플라스미드 DNA 분석 토의 TBE/TAE 차이

Agarose gel 전기영동을 통해서 플라스미드 DNA의 DNA크기를 알아보기 위한 실험을 하였다. 먼저 agarose와 1x TAE buffer로 1% Agarose gel을 만든다. Agarose gel은 그물망으로 되어 있어서 DNA를 크기별로 분류해 주는데 Agarose의 농도에 따라 그물망의 크기가 달라진다. Agarose의 농도가 낮을수록 그물망이 커져 크기가 큰 DNA를 분류하고 농도가 높을수록 그물망의 크기가 작아져 크기가 작은 DNA를 분류할 수 있다. Agarose gel을 만들고나면 1x tae buffer로 채워진 전기영동 키트에 well이 있는쪽이 –극쪽으로 오도록 설치하는데, 이는 DNA가 –charge를 띄고있어 전압을 걸어주면 +rmrWhrdmfh 이동하기 때문이다. Agarose gel을 설치하고 나면 extraction 한 플라스마 DNA sample 1마이크로리터와 d.w 4ml 6xloading dye 1마이크로리터를 pipeting 하여 준다.  6xloading dye는 분자량이 큰 무거운 물질인 glycerol이 함유되어 있어서 Dna가 든 시료가 buffer에 뜨지않고 gel 상의 well 안으로 가라앉게 하고 군청색을 나타내는 bromophenol blue 가 들어있어 전기영동하는 동안에 눈에 보이지 않는 dna가 현재 어느정도 이동했는지 눈으로 보아 알수있게 해준다. Loading dye도 –charge를 갖고 있어서 전기영동시 DNA나 protein 등과 같이 이동하는 것이다. 시료들을 pipeting 해 주고 나면 pipeting 해주고난 sample 6마이크로리터를 agarose gel에 넣어주는데 이때 첫번째 well에는 dna의 size를 알기 위하여 size marker 3마이크로리터를 넣어준다. Well에 sample을 넣어줄때는 popet을 수직으로 세우고 왼손으로 popet이 떨리지 않게 고정시켜준 후 popet의 끝을 well에 닿게 하고 sample을 넣어주는데 이때, 실수로 agarose gel이 찢어지지 않도록 주의해야 하고 sample을 넣고 난 뒤에 popet을 누른 상태에서 빼내도록 해야한다. Well에 sample들을 다 넣어주고 나면 전기영동 키트에 전압을 걸어주는데 이때 +-극이 바뀌지 않게 조심하고 100v로 약 25분간 전압을 걸어준다. 전압을 걸어주게 되면 –charge를 갖는 dna는 +극 쪽으로 내려가게 되는데 이때 loading dye는 파란색과 보라색으로 나뉘게 된다. Gelloading이 끝나면 agarose gel을 EtBr은 DNA 이중나선의 사이에 끼어들어서 나중에 gel에 자외선을 쬐면 DNA에서 형광이나와 눈에보이도록 하는 역할을 하지만 매우위험한 발암물질 이기 때문에 조심 해야한다. DNA 1bp는 1염기쌍을 뜻한다.

 

 TAE; Tris-acetate-EDTA

TBE; Tris-borate-EDTA 

둘다  DNA 전기영동에 사용한다.

일반적으로 TBE가 TAE 보다 buffering capacity가 더 좋아 전기영동을 길게 할 경우 TBE가 더 적합하다고 하며, TAE는 긴 DNA (>12kb)를 전기영동할 때, TBE는 보다 짧은 크기의 DNA를 전기영동할 때 (<1 kb) 좋다. 그러나 DNA를 elution(용리) 할 때는 borate가 방해하기 때문에 TAE를 주로 사용한다. 

TAE는 너무 반복해서 사용할 경우 DNA band가 smear해 질 가능성이 높고, TBE는 buffering capacity가 좋아서 TAE보다 좀 더 오래 사용할 수 있다.

 그러나 보통 실험실에서는 보통 TAE를 더 많이 사용하는데 이는 실험실에선 gel elution을 많이 하는데다가 TAE, TBE를 번갈아 가며 사용하면 복잡하기 때문에 그렇고, TAE만 사용하더라도 실험에는 큰 무리가 없다.

 acrylamide gel을 이용해서 전기영동하는 경우는 대체로 TBE를 사용한다.

buffering capacity가 더 좋아야 하기 때문이고, high voltage에서 열이 덜 나기 때문에 gel이 녹는 것을 방지할 수 있다.