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  1. 2009.08.11 배지의 제조 및 세균의 분리 및 배양, 멸균법

실험. 배지의 제조 및 세균의 분리 및 배양

Ⅰ.Introduction


1.배지의 정의
배지: 적당량의 영양성분을 혼합해서 미생물을 생존시키고 지속적으로 증식시키기 위해서 인공적으로 증식환경이 만들어진 상태, 미생물을 생육시키기 위한 각종 영양소의 혼합물을 말한다.


2. 배지의 주요성분


(1)펩톤(peptone): 카제인, 동물의 육류 등의 단백질을 pepsin 또는 trypsin, pancreatin등의 효소로 소화시켜서 미량의 proteose를 함유한 작은 분자의 황색 분말로서 수용상태에서는 황갈색의 약한 산성을 나타낸다.


(2)육즙성분(meat extract 또는beef extract): 쇠고기의 근육부분에서 수용성 침출 물을 추출해서 농축시켜 만든 것으로 염류, 발육소, 핵산성분, 기타 당분, 아미노산, 비응고성 단백질을 제공한다.


(3)효모추출물(yeast extract): 효모에서 추출한 수용성 침출물질로서 담황색 분말이다. 염류, 발육소, 핵산성분, 당분, 아미노산, 비 응고성 단백질 등을 세균대사에 제공한다.


(4)젤라틴(gelatin): 동물의 뼈, 피부, 인대, 건 등을 끓여서 그 액체를 건조시킨 황갈색의 입자 또는 분말이며 일명 아교라고도 한다.
처음에는 고형배지에 응용되었으나 용해 온도가 37℃ 이하이기 때문에 근래에는 단백질 분해시험 중의 하나인 젤라틴 분해효소 검출을 위해 사용한다.


(5)한천(agar): 바다의 홍조류에서 추출되며 고체 배지의 조제시 유용한 성질을 갖고있다. 극히 일부 미생물을 제외한 대부분의 미생물은 한천을 분해하지 못한다.
따라서 한천은 미생물이 생육하는 동안고체 형태 그대로 존재한다. 한천은 100℃에서 액화되며 40℃에 도달할 때까지도 액상으로 존재한다. 한천은 일단 굳게 되면 배양온도가 100℃가 되어도 용해되지 않고 고체 상태로 존재한다.


3. 배지의 종류


(1) 재료에 따른 분류


①천연배지: 배지 재료가 천연물로서 그의 화학조성이 확실히 알려져 있지 않은 배지를 천연배지라 한다. 감자한천, Oat meal 배지, 볏짚 배지 등이 있다.

②합성배지: 화학조성이 알려져 있는 재료만으로 만들어진 배지로서 Czapek – dox 등이 있다.

③반합성 배지: 합성 배지 성분의 일부를 peptone, yeast extract 등 화학조성이 밝혀 지지 않은 천연물로 바꾸어 놓은 배지이다.


(2) 사용형태에 따른 분류

①액체배지: 한천이 들어있지 않은 액상의 배지이며 이들은 미생물의 중식에 이용되고, 세균의 생화학적 검사, 증식, 대사산물을 검출할 목적으로 쓰인다.

②고체배지: 액체배지에 한천, 젤라틴 혹은 실리카겔 등을 첨가하여 굳힌 것으로 미생물의 보존배양, 순수보리 등에 사용된다. 사용목적에 따라 다음과 같이 분류할 수 있다.
ⓐ 평판배지(plate media): 배양접시에 배지를 약 4mm두께 정도 넣어 굳힌 것이 평판배지인데 주로 호기성 미생물의 분리배양, 집락의 관찰 등에 이용된다.
ⓑ 고층배지(butt media): 시험관을 세운 배지를 굳힌 것으로 주로 세균의 성상 검사, 통성 혐기성 세균의 보존, 세균의 유동성 검사 등에 이용된다.

ⓒ 사면배지(slant media): 시험관에 배지가 약 45도 경사가 되도록 굳힌 것으로 호기성 미생물의 증식, 보존 등에 쓰인다.
ⓓ 반사면 배지(semislant media): 고층 배지의 ⅓정도를 경사지게 만든 것을 반고층배지라고 한다. 세균의 생화학적 검사 등에 쓰인다.



3) 사용목적에 의한 분류


① 보통 배지: 보통배지는 될 수 있는 한 많은 미생물이 생육할 수 있도록 제조된 배지로서 세균용으로는 nutrient broth, nutrient agar, 사상균용으로는 감자한천, oat meal 등이 있다.

② 특수배지: 특수배지에는 선택배지, 판별배지, 증식배지, 생화학적 시험용 배지 등이 있다.

(a) 선택배지: 목적하는 미생물의 생육을 증진시키고 다른 미생물의 생육이 억제되도록 만들어진 배지로서 토양 혹은 병든 조직에서 목적하는 균을 분리 배양하기 위해서 많은 선택배지가 고안되고 있다.

(b) 판별배지: 미생물의 생화학적 성질을 이용하여, 여러 미생물이

혼재되어 있는 곳에서 목적으로 하는 미생물을 판별 또는 확인하기 위해서 만들어진 배지이다.
(c) 증식배지: 보통배지에서는 생육이 잘 안되거나, 또는 생육이 나쁜 미생물의 생장, 증식을 촉진시키는 것을 목적으로 하는 배지이다.

(d) 생화학적 실험용 배지: 생화학적 성질의 조사나 위한 것이나 세균의 분류, 동정을 위해 여러 종류가 개발되어 있다.


4. 희석법


(1) 획선평판법: 백금이를 사용하여 혼합시료를 페트리 접시 중의 고체 배지 표면에 종횡으로 여러 번 긋는다. 이론적으로는 이같이 백금이를 고체 배지 표면에 반복하여 긋는 동안 백금이로부터 세균이 차례로 떨어져 나오고 각각의 세포는 생육하여 균락을 형성하게 된다.


(2) 평판도말법: 희석된 시료를 소량 취해서 고체 배지의 표면에 넣고 rodder를 사용하여 도말시킨다. 균액의 많고 적음에 관계없이 순수배양 집락을 얻기 위한 가장 기본적인 방법이다.


(3) 주입평판법: 시료를 여러번 희석하여 각각의 희석 액을 소량 취해서 용해된 각각의 고체배지와 혼합하여 페트리 접시에 붓는다. 이때 몇몇 페트리 접시에서는 분리된 군락이 형성될 것이다.




5. 콜로니(colony)


고체 배지에서는 육안으로도 볼 수 있는 콜로니가 형성된다. 세균 또는 단세포 조류. 균류 등이 육안으로 볼 수 있는 집단이다. 대장균이나 고초 균과 같이 증식이 빠른 균을 적당한 배지에서 배양하면 24시간 이내에 육안으로 볼 수 있는 콜로니를 만드는데 결핵균등은 1주일 이상이 소요된다. 콜로니의 형성은 균의 종류나 배지의 조성, 배양시간, 온도, 습도 등 많은 요인에 의하여 영향 받는다.
콜로니의 성상을 크기, 모양, 빛깔, 투명도, 굳기 등에 대하여 관찰된다. 균종을 동정하는데 참고 할 수 있다. 또한 특히 세포의 경우에는 일정한 배지조건 아래서 단일종의 콜로니의 형태로 종의 특징으로 거론되는 일이 있다.


6. 멸균과 소독의 차이점
멸균과 소독은 모두 살균에 포함되는 말이다. (살균은 미생물체의 번식 능력을 완전히 손실 시키는 과정을 의미한다) 멸균은 어떤 물체에 있는 모든 생명체가 제거되었거나 죽은 상태를 뜻하고 소독은 감염을 시킬 수 있는 미생물을 제거하는 방법을 뜻한다.
소독은 점염 병의 전염을 방지할 목적으로 병원균을 말살하는 것으로 병원균의 멸살에 대해서는 별로 문제시하지 않는다. 이에 반해, 멸균은 병원성과 비병원성을 불문하고 미생물을 멸살하는 것으로 멸균 후에는 무균상태가 된다.



8. colony의 육안적 관찰


1) 집락(colony)의 질:

① smooth colony(활면형 집락) -물방울 모양 윤기 있는 집락

② rough colony(조면형 집락) - 빵부스러기 모양의 깨지기 쉬운 집락

③ mucoid colony(점액성 집락) -끈끈한 건조성의 융합성 집락


2) 집락의 형태

① punctiform colony: 반점모양의 작은 집락

② circular colony -원형모양의 작은 집락

③ filamentous colony - 섬유상의 작은 집락

④ spindle colony - 방추성 작은 집락

⑤ rhizoid colony - 식물의 뿌리모양 작은 집락

⑥ irregular colony -불규칙의 작은 집락


3) 집락의 고도

① flattern colony - 평판에 납작하게 붙은 집락

② raised colony - 약간 평평융기

③ convex colony - 불룩 용기

④ pulvinate colony - dome 모양

⑤ umbonate colony - 배꼽 모양



4) 집락 가장자리

① entire - 가장자리 둥근

② undulate -가장자리 파동

③ lobate - 가장자리 엽상

④ serrate - 파상형 톱니모양

⑤ filamentous - 섬유상

⑥ curled -곱슬머리형


Ⅱ. Goal



1. 배지에 한천을 사용하는 이유를 알고 직접 배지를 만들 수 있다.

2. 획선 평판법과 도말평판법을 사용하여 세균을 분리 할 수 있고 분리된 균을 순수배양할수있다.


Ⅲ. Materials and Methods


◇ 배지만들기


1. Materials


Bacto Beef extract(0.9g), Bacto peptone(1.5g), Bacto agar(4.5g), 250ml 삼각 플라스크, 100ml 메스실린더, 증류수, 유산지, 저울, 압력솥, 멸균한 페트리 접시(개), 알코올램프


2. Methods


① 증류수 250ml Bacto Beef extract (0.9g), Bacto peptone(1.5g), Bacto agar(4.5g) 을 넣고 녹인다.
② 이 배지를 압력솥에 넣고 121℃ 1.5 기압 약 15분 가량 고압증기 멸균한다.
③ 멸균된 배지를 불꽃 가까이에서 plate의 반 정도가 차게끔 (20ml)부어준다.
④ clean bench에서 말린다.

◇ 세균의 분리 및 배양

<도말 평판법>
1. Materials
피펫, rodder, 에탄올, 알코올램프, 한천배지
2. Methods
① 피펫을 사용하여 한천배지의 중앙에 소량의 시료를 떨어뜨린다.
② rodder를 에탄올에 담근다.
③ 에탄올에 적신 rodder를 불꽃에 통과시켜 휘어진 부분을 멸균한다.
④ 멸균한 rodder를 이용해 한천배지에 시료가 골고루 퍼지도록 도말한다.


<획선평판법>


1. Materials
현탁액, 백금이, plate


2. Methods
① 현탁액을 잘 흔들어준다.
② 백금이를 불에 달구어 멸균한다.
③ 백금이를 냉각시킨 후 현탁액을 취한다.
④ plate 에 도말한다. (1,2,3 차 도말)
⑤ 사용한 백금이를 불꽃에 살균한 후 제자리에 둔다.
시험균액을 한쪽 골고루 바른다. 1차도말을 2~3회 하고나서 2차도말을 하면 2차도말 부위는 1차 도말부위보다 세균수가 감소하게 된다. 2차 도말부위를 2~3회 하고나서 3차 도말을 한다. 이부위는 2차 도말부위보다 균수가 감소하게 된다. 그러므로 독립된 순수배양 집락을 얻을 수 있게된다.


Ⅳ. Results



첫 번째 배지는 획선평판법으로 19호관 2층 정수기 물을 채취하여 한 것이다. 콜로니는 2개가 생겼는데 위에 것은 럭비공처럼 생긴 것으로 형태는 spindle(방추형)이었다. 밑에 것은 둥그런 모양으로 원형이었다. 실제크기는 약 0.2mm이었다. 콜로니의 질은 직접 만져보지는 못했지만 smooth colony 으로 물방울 모양의 윤기 있는 것이었다. 평판위에서 바라본 형태는 방추형, 원형이었고 측면에서 보면 약간 평평융기형(raised colony)이었다. 콜로니(colony)의 가장자리는 둥근형(ebtire)이었다.
색깔은 상아색보다 연한 색이었다,
두 번째 배지는 도말평판법으로 옆의 시료의 장소가 같은 곳에서 채취해온 정수기 물을 사용했다. 획선평판법에 비해 콜로니가 많이 생겼다. 총 16개로 형태는 반점형(punctigorm)이고 실제크기는 0.3mm부터 작은 것까지 다양했다. 질과 형태, 가장자리, 색깔 모두 획선 평판법의 결과랑 같았다.

첫 번째 배지는 획선평판법으로 19호관 밑의 연못물에서 채취하여 도말한 배지에서 생긴 콜로니이다. 총 5개로 왼쪽은 원형이고 오른쪽은 반점형이었다. 크기는 오른쪽의 큰거 하나를 제외하고는 제일 작은 콜로니였다. 오른쪽 콜로니는 개 발자국 모양을 하고 있었으며 균락의 높이는 작은 콜로니들은 평평형처럼 납작했고 크기가 조금 큰 콜로니는 융기형이였다. 콜로니의 가장자리는 역시나 둥근형이었다.
색깔은 역시나 앞과 같이 상아색보다 연한 색이었다.
두 번째 배지의 콜로니는 도말평판법을 이용해서 생긴 것으로 이것 역시 시료가 연못물이다. 약 90여개로 내가 미처 그리지 못한것도 있을수 있고 하니까 너무 많아 셀 수 없음(TMTC, too many to count)이라고 쓰는게 더 낫겠다.
콜로니가 별로 없는 plate에 비해 탁도가 아주 조금있었다. 그리고 미생물 세포가 덩어리져있는게 꽤 많았다. 줄줄이 콩사탕처럼 생긴 것도 있었다. 반점 형이고 평평형과 융기형이 골고루 있었다. 색깔은 상아색이었다.


첫 번째 배지는 율무차를 현탁액으로 해서 plate에 도말한 획선평판법이다.
여기서는 한 개의 콜로니도 찾을수 없었고 그은 획선만 보일 뿐이었다.
두 번째 배지는 도말 평판법이다. 시료를 자판기의 율무차를 이용했고 콜로니는 없었고 배지에다가 율무차를 도말해서 율무차가 엉켜있는것처럼 되어있었다.

Ⅴ. Discussion
이번 실험은 배지를 직접 만들어서 획선평판법과 도말평판법을 사용하여 균을 분리하고 분리된 미생물(균)을 배양하여 생긴 콜로니를 관찰하는 실험이었다.
3가지 시료(정수기물, 연못물, 율무차)를 가지고 콜로니를 얻어낸 결과 율무차를 제외한 나머지 정수기물과 연못물에서는 2개이상의 콜로니를 발견할수있었다.
다른 plate에서의 콜로니는 다들 떨어져있는 반면에 연못물을 시료로 쓴 도말 평판법에 나타난 콜로니는 많이 서로 겹쳐있엇다. 이러한 현상이 일어나는 이유는 녹이 한천배지를 잘 식히지 아니한 상태에서 페트리 접시에 부으면 뚜껑에 물기가 서려 물방울이 크게 맺히게 되고 이 물방울이 평탄위에 떨어지면 콜로니들이 퍼져 서로 겹치기 때문에 단일집락을 얻을 수없었던 것이다. 또 세균 배양 시에 rodder를 이용해서 접종시킬 때 잘못해서 그럴 수도 있다고 했다. 페트리 접시에 한천배지를 붓고 나서 거꾸로 엎었다고 해도 그 짧은 사이에 한천 배지가 다 식지 않았는지 이미 물방울이 맺혀 있었고 그게 떨어져서 이렇게 번진 것이다. 콜로니들이 많이 뭉쳐져 있는 곳은 색깔도 약간 더 짙었다.
획선 평판 법을 이용하여 미생물을 배양한 것은 콜로니가 많이 보이지 않았다.
2~5개 정도였다. 백금이로 그을 때 잘 긋지 못해서 그런 것 같다. 긋다보면 배지가 찢어지고 잘 그어지지 않아서 잘 그을 수가 없었다.
율무 차는 두 가지 방법으로 했지만 콜로니가 생기지 않았다. 그 이유를 생각해보니 증식이 빠른 균은 24시간 이내에 볼 수 있지만 1주일 이상 걸려서 만들어지는 콜로니도 있다. 율무차 안에 들어있는 균이 이런 경우 일수도 있다 아님 균의 조성이나 온도, 습도, 배양시간에 따라 생길수도 있고 안생길수도 있는데 저 앞의 3가 조건은 다 공통적이기 때문에 아니다. 그러므로 균의 조성, 종류가 달라서 안 보인것 같다.
배지를 만들때 ph를 7.0으로 맞추는 이유는 미생물의 환경에서는 ph 농도가 미생물의 생장에 굉장히 중요한 환경요인의 하나이다. 미생물이 가장 잘 생장할 수 있는 ph의 범위를 최적 ph라 하는데 미생물 종류에 따라 다르다.
미생물 배지는 미생물 성장에 적합한 ph를 지녀야 한다. 실험실에서 사용하는 대부분의 배지들은 중성부근의 ph로 되어있지만 미생물의 대사 결과에 따라 배지 ph가 변한다.
탄수화물의 분해로 인해 산성으로 단백질 분해로 인해 알칼리로 변하기 때문에 미생물 발육에 영향을 끼칠 수 있다. 배지의 ph가 크게 변하면 미생물의 성장이 억제된다. 이 영향을 제거하려고 배지 속에 화학물질인 완충제가 들어있다. ph값은 7이하 이면 산성 ph의 값이 7이상이면 알칼리성이다. 대부분의 미생물은 중성에서 잘 자라기 때문에 배지 제조에서 ph를 7.0을 맞추는 것이다. 그리고 배지는 고압증기 멸균기를 사용할 때 121℃에서 15분 정도 가열, 멸균하는 것을 꼭 지켜야한다.
왜냐하면 너무 가열하게 되면 대부분의 배지 성분이 손상되기 때문이다.
배지를 뒤집어서 배양하는 이유는 막 자라나는 세포들은 밑 부분부터 차오른다고 생각할 수 있는데 그렇게 되면 윗부분의 세포들은 영양섭취가 어렵게 된다. 따라서 중력에 의해 어느 정도 자란 세포들이 윗부분으로 가주어야 밑 부분의 새로운 세포들이 잘 형성 될 수 있다.
또 한 가지 이유는 배지가 있는 plate를 원상태로 놓고 키우게 되면 물방울이 맺히고 이 맺힌 물방울은 위에서 아래로 떨어진다.
떨어진 물은 다시 증발하거나 배지에 흡수되기도 하지만 배지를 타고 옆으로 흐를 수도 있다.
물이 번지는 중에 만약 콜로니기 있다면 물을 따라 옆으로 퍼져나갈수 있게 되고 그렇게 되면 하나의 균이 하나의 콜로니를 생성하게 된 것인지 아니면 번져나간 여러균 중에서 몇몇이 모아서 콜로니를 만들었는지 구별하기 힘들기 때문이다.
처음부터 250ml를 맞추지 말고 우선200ml 맞추고 나머지 50ml를 맞추는 이유는 우선 200ml 정도쯤에 Beef extract0.9), Bacto peptone(1.5g), Bacto agar(4.5)을 넣어준 다음에 나머지 증류수를 부어 250ml 맞추는데 처음부터 250ml을 맞춘다음에 배지 성분들은 넣어주면 처음 원했던 250ml을 넘기 때문이다.
획선 평판법보다 도말평판법에서 colony가 많이 나온 이유는 도말평판에서는 rodder로 plate 구석구석 도말하여 균이 잘 배양 된 반면에 획선평판법은 백금이로 그으면서 배지가 찢어지고 잘 긋지 못해서 도말이 잘 안된것 같다.하지만 획선평판법도 많은 수의 colony를 얻을 수 있다. 단지 도말은 rodder로 배지위를 고루고루 퍼뜨리기 때문에 많은 수처럼 보이는 것 뿐이다. 획선평판법은 백금이로 처음에는 농도가 짙어지다가 옅어지면서 나중의 단일 colony를 얻기에는 도말보다 장점이 있다.


Ⅵ. Reference
미생물학 실험 고영진 외 19인 2002.3.10 월드 사이언스 p.21~35
미생물학 실험 방병호외 7인 2000.1.10 진로연구사 p.43~53
최신 미생물학 실험 박석기외 5명 1987.3.10 신광문화사 p.61~73
대학 미생물학 민경희 외 2인 1995.2.20 탐구당 p.99~127

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Posted by 찬재
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