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  1. 2009.08.11 PCR (중합효소연쇄반응)

Class III β-tubulin (primer)

Class III β-tubulin, otherwise known as βIII-tubulin or β-tubulin III, is a microtubule element of the tubulin family found almost exclusively in neurons.

It is possible to use monoclonal antibodies and immunohistochemistry to identify neurons in samples of brain tissue, separating neurons from glial cells, which do not express Class III β-tubulin.
 위키피디아

복제에는 프라이머 라고 불리는 dna 나 rna 로 된 시발체사슬이 복제에 요구된다 dna 복제에서 프라이머는 짧은 단일사슬 rna 이다. 이 rna 사슬은 dna 주형 사슬에 대해 상보적인데 프라마아제 라고 불리는 효소에 의해 한 번에 한 뉴클레오티드씩 합성된다. 그 후 dna 중합효소는 그부분의 dna 복제가 다 끝날 때 까지 프라이머의 3'말단에 뉴클레오티드를 계속하여 첨가한다. 그 다음에 rna 프라이머는 분해되고 dna 가 그곳에 첨가되며, 그 결과 생성된 dna 절편은 다른 효소의 행동에 의해 연결된다. dna 복제가 완료 되면 각각의 딸분자는 오직 dna 로만 이루어져 있게 된다.


중합효소연쇄반응(pcr) 기술은 본질적으로 시험관 안에서 짧은 구역의 dna 를 여러번 복사함으로써 이 과정을 자동화한다
pcr은 다음 일련의 단계가 여러 번 반복되는 주기적인 과정이다
이중사슬 dna는 온열(90~96도)에 의하여 단일사슬로 분리(변성)된다
짧고 인공적으로 합성된 프라이머가 네 종류의 데옥시리보뉴클레오시드3인산(dATP, dGTP,dCTP,dTTP) 및 DNA중합효소와 함께 혼합물에 첨가된다. 염기간의 결합은 G와 C는 세군데에서 수소결합이 일어나고 A와 T는 두군데에서 결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주는것이 좋다.
DNA중합효소가 상보적인 새로운 사슬의 생산을 촉매한다.
한 주기는 수분이 걸려 DNA 의 양을 두배로 만들고 새로운 DNA를 이중사슬 상태로 남긴다. 이론적으로는 주기를 여러번 반복하면 DNA 서열의 사본수가 기하급수적으로 증하될 수 있다.

PCR 기술을 사용하기 위해서는 표적DNA 각 사슬의 3'말단에 있는 염기서열이 밝혀져서 보통 15~30개 염기의 길이이며, 상보적인 프라이머를 실험실에서 만들 수 있어야한다.
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 실험에 이용할 PCR 시험관에 다음과 같이 실험에 사용할 재료들을 혼합하고 pipette으로 잘 섞는다.

 

Template DNA(100 ng/μl) 1 μl

Upstream primer(12.5 pmole/μl)1 μl

Downstream primer(12.5 pmole/μl) 1 μl

dNTP(dA, dC, dG, dT 2.5 mM-each) 2 μl

10x PCR 완충용액 5 μl

증류수 39 μl

Taq DNA polymerase(1 unit/μl) 1 μl (총 부피 50 μl)

[출처] PCR의 기본 원리 와 그 응용성|작성자 조다니엘

 


전기영동
DNA는 인산기 때문에 중성의 PH에서 음전하를 띠고 있다. 이러한 DNA 절편의 혼합물을 다공성 겔의 WELL에 올려놓고 겔을 따라 음극과 양극을 갖는 전장을 걸어준다. 역전하가 끌기 때문에 DNA는 전장의 양극의 방향으로 이동한다. 다공성의 겔은 체와 같이 작용하기 때문에 보다 작은 절편은 보다 큰 것에 비하여 더 빠르게 움직인다. 정해진 시간 후에 그리고 아직DNA 절편이 겔안에 있을때 전력을 끈다. 그런후에 형광을 내는 염료로 분리된 절편을 염색함으로써 자외선을 비췃을대 보이게 할 수있다. 그대 이들은 막대나 반점으로 보이며 조사하거나 개별적으로 추출할 수 있다
전기영동은 다음의 두가지 형태의 정보를 제공한다.
절편의 크기, 특이한 DNA 서열의 존재
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각 문단끝의 숫자는 페이지 책은 우리가쓰는 사자책


이번에실험한 RT-PCR은 지난번 실험에서 추출해놓은 RNA 로 5가지 종류의 primer 와 역전사효소를 이용해서 rna로 cdna를 만들어 역전사시키고 이것을 PCR 즉 복제연쇄반응을시켜 소량의 cDNA 를 대량으로 증폭시킨 후 전기영동을하는것이다. pcr 은 아주 소량의 유전물질 만 있어도 연구하고 싶은 유전자는 무엇이든 대량 생산이 가능하게 해주는 기술이라 할 수있다.  PCR 을 한 후 전기영동으로 -charge를 가진 dna를 +극쪽으로 끌어당겨 dna 의 size 별로 분리해내어  우리가 원하는 size 의 DNA를 추출 할 수 있다. 전기영동에 쓰인 gell 은 1% agarose gell 을 사용하였다. gell의 %를 조절함으로 DNA가 loading되는 속도를 결정할 수 있다.
annealing 은 사용할 물질의 G C, A T 의 포함된 비율의 정도를 보고 조정하여야 한다.
 전기영동을 할때에는 시각적으로 dna들을 보기위해 EtBr을 첨가해 주는데 Ethidium bromide(EtBr)은 DNA 염기 사이로 끼어드는 평면구조를 가진
그룹을 지니고 있어서 DAN 사이로 무척 잘 들어갈 수있다. 이 그룹이 DNA 염기에 결합하면 유리형의
ethidium bromide보다 형광이 증가되어  uv하에서 발광하게 되고, DNA band를 시각적으로 확인하게 해준다.Ethidium bromide는 한가닥과 쌍가닥 DNA및 RNA 검색에 모두 사용할 수
있으나 염료의 친화성이 외가닥에서보다 쌍가닥에서 더 강하다. Ethidium bromide는 강력한 발암물질이고 독성을 지니므로 이 염색액을 다룰 때에는 반드시 비닐장갑을 사용해야한다. 사용 후에는 이 용액은 정화한 후 버려야 한다.
또한 TBE를 첨가 해 주는데 TBE는 Tris Borate EDTA를 줄인 말로서 전기영동에서의 버퍼역할을 한다.
TBE는 짧은 크기의 DNA(<1 kb) 를 전기영동할 때  사용한다. TBE는 같은역할을 하는TAE 보다 좀더 오래 사용 가능한데 이는 buffering capacity가 더 좋기 떄문이다.
조교님이 적어주신 size marker 에 의하면 1000bp 와 500bp 에서 진하게 분리되는데 시간관계상 pcr을 여러번 돌리지 않아 ( 25 cycle )프라이머 GAPDH 를 사용한 실험결과 이외의 것은 거의가 제대로 된 결과가 나오지 않았다. 내가 사용한 프라이머는 베타-튜블린 3 로 실험결과가 제대로 나온 것 같지 않았다.

Posted by 찬재
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