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  1. 2009.08.11 tissue를 이용한 RNA 분리, cDNA 합성

초기에 많은 연구자들은 게놈에서 전사된 1차 산물인 RNA의 모든 종류를 모아 유전자의 종류나 유전자수를 파악해 왔다. 1차 산물인 RNA는 단일나선으로 불안정하며 또한 수명이 짧기 때문에 연구자가 시험관내에서 취급하기가 쉽지 않다. 그러나 RNA는 인위적으로 이중나선인 DNA로 전환시킬 수 있다. 이렇게 만들어진 것을 cDNA(copy 또는 complementary DNA)라고 부른다. 따라서 cDNA의 개수로부터 게놈의 유전자 개수를 알 수 있는 것이다. 물론 하나의 cDNA 자체가 바로 하나의 유전자를 의미하지는 않는다.

유전자를 찾는 더 확실한 방법은 cDNA를 얻어 게놈지도 상에서 해당하는 부분을 역추적하는 작업이다. cDNA란 mRNA로부터 거꾸로 얻어낸 DNA 가닥으로 유전자에서 실제 엑손부분에 해당하기 때문에 어느 부분이 유전자인지 확실히 알 수 있다.

 

rna에서 cdna 합성이유

 

cDNA(complementary DNA)는 그 의미에서도 알 수 있듯이 일시적인 실험목적으로 만드는 것입니다. 이러한 cDNA를 제작하는 이유는 첫째, exon에 대한 정보를 얻고자 할 때, 둘째, 진핵생물의 유전자 산물을 얻고자할 때 제작하게 되는데, 원핵생물에는 mRNA splicing이 없기 때문이죠.

 

 

DNA

RNA

5탄당

데옥시리보오스

(2번탄소에 수소가 붙어있다; 리보오스에 비하여 산소원자 하나가 적다;

DNA가 RNA보다 안정성이 높다)

리보오스

(2번탄소에 히드록시기가 붙어있다)

염기

A T G C

A U G C

위치

핵(그 외에 미토콘드리아와 엽록체에)

주로 세포질

형태

이중나선으로 분자가 길다.

단 바이러스의 DNA는 외가닥이다

외가닥으로 존재한다. 때로 rRNA나 tRNA는 3차 구조나 2차 구조를 이루기도 한다. DNA는 단 한 가지 형태뿐이지만 RNA에는 기능이 서로 다른 몇 가지 종류의 분자가 있다. (mRNA, rRNA, tRNA)

성질

DNA는 자연적인 분해나 효소에 의한 분해에 잘 견디며, 손실되더라도 반대 사슬이 상보적 정보를 가지고 있기 때문에 회복 가능하다.

RNA는 DNA에 비하여 -OH기를 하나 더 가지고 있기 때문에 화학적 반응성이 더 크고 일단 변형되면 회복 또한 불가능하다.

 

5-② RNA 분리 과정 중에 주의해야 할 것은 어떤 것이 있는가?

-RNA는 구조가 불안정하여서 RNAase에 의해 쉽게 분해가 된다.

-RNAse는 체내에 손, 눈물, 침 등에 많이 포함되어 있으므로 실험 중에 접촉하지 않도록 주의를 한다.

-시약에 DEPC(RNase inhibitor)를 처리한다.

-용기나 tip은 재사용하지 않는다.

 

5-③ DEPC-treated water를 쓰는 이유는 무엇인가?

DEPC-treated water는 RNA inhibotor 이다. 그래서 이것은 RNase의 작용을 방해하고 없애 주어서 순수한 RNA를 얻을 수 있다. 대부분의 RNase의 active site에는 Histidine이 있고, DEPC는 효과적으로 RNase를 비활성화 시켜준다.

[출처] 동물세포로부터 RNA분리, CRNA의 합성, PCR에

 

 

rna 분리

electrophoresis나 density gradient centrifugation 혹은 ion exchange chromatography등의 방법으로 순수 분리할 수 있다.

토의

이번실험은 rt-pcr 중 rna를 분리해 내는 것으로 trizol을 이용한 실험이다. 이 실험은 지난 실험인 cell harvest , cell counting 에 이어지는 실험이라고 할수 있다.
central dogma 에 따르면 dna - rna - protein 순으로 만들어 지나 이번실험은 역전사효소를 사용하여 rna 에서 dna 를 즉 cDNA 를 만든다.
여기서 굳이 cDNA 를 만도는 이유로는 단백질을 만들어내는 RNA는 실제로 단백질을 구성하는 아미노산을 합성할수 있는부분인 엑손과 아미노산을 합성하지않는 인트론으로 구성되어 있다. DNA 사용하게되면 불필요한 인트론으로 인해 정확하게 단백질로 코딩되는 코돈을 알기 힘든데 RNA 에서 cDNA를 만들면 엑손만을 구할수있기때문에 cDNA를 만들어 실험하는것이다.
RNA 분리시 제일 처음 Tri-reagent 를 처리하는데 Tri-reagent (trizol) 은 RNA 를 분리하는 시약이다.
 Trizol reagent에는 monophasic phenol이 guanidinium thiocyanate와 함께 들어있다. 여기에서 세포를 깬 후 chloroform 또는 BCP라는 시약을 첨가하면 비로소 층이 갈리게 되는데, RNA는 상층액에 남아있게 되고 이 층을 건져 침전시키면 되는 것이다. . Trizol 1마이크로리터당 chloroform 200마이크로리터를 넣어준다. 여기서 넣어주는 choloroform 은 당류와 단백질등 원심분리후 제거되지 않은 찌꺼기를 제거해 주는 역할을 한다. cholorofom 을 첨가한 후 14000rpm, 4도씨 에서 15분간 centrifuge 한후 sup 을 옮겨내고 isoprophanol을 첨가해 주는데 isoprophanol은  핵산류를 침전시켜 RNA 를 농축, 침전 시켜주는 역할을 한다.
rna 분리 의 마지막단계로 depc water 를 첨가해 주는이유는 RNase 때문인데 이 RNase 는 단일나선의 RNA 를 분해시키는 RNA 분해효소로 RNA 가 파괴될 위험이 있으므로 넣어주는것이다.
DEPC는 histidine을 선택적으로 alkylation시키는 물질이다. 대부분의 RNase들의 active site에는 Histidine이 있고 따라서 DEPC는 효과적으로 RNAse를 inactivation시킬 수 있는 것이다.
이에 RNA 관련된 실험에 쓰이는 물이나 buffer등에 DEPC가 많이 쓰인다.
단 아민기가 많은 Tris Buffer등에는 사용할 수 없는 점에 주의하여야 합한다.
다른 효소들 그리고 RNA에 영향을 줄 수 있기 때문에 DEPC를 처리한 물은 대개 DEPC를 제거해야 한다. 사실 DEPC는 물속에서 Half-life가 30분정도 밖에 되지 않고 그 산물역시 EtOH 와 CO2 이기때문에 Autoclave등으로 (0.5-1 hr) 쉽게 제거할 수 있다. DEPC를 처리한 용액에서 향긋한 냄새가 나는데 이것은 DEPC용액내의 불순물들로 인한 부산물인 에테르 이기때문이다.
DEPC 처리 이외에도 autoclave, baking, RNA work 만을 위한 용기를 사용함으로서 RNAase로부터 RNA를 보호할 수있다.
세포가 파괴되면서 나오는 endogenous RNase 방지로는
Guanidine HCl, Guanidinium thiocyanate : potent denaturing agent로 세포의 파괴와 RNase inhibition이 동시에 이루어진다.
rna 분리후 cDNA 합성에서는 oligo DT 를 사용하게되는데 우리가 분리해 낸 RNA 에는 A 사슬이 많이나오는데 oligo DT 에는 T 사슬이 많이있어 RNA 를 인지하는 primer 로서 사용된다. 여기에서 incubation 을 65도씨~70도씨에서 10분간 incubation , ice 에서 10분간 incubation 하게 되는데 ice 에서 10분간 넣어두어야 뭉쳐있던 RNA 가 풀리게 되기 때문이다
Posted by 찬재

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