DNA prep, gel electrophoresis, Southern blotting

DNA를 분리하고, gel electrophoresis와 Southern blotting을 순서대로 실시했다.

먼저 DNA를 얻기 위해 DNA를 정제했다. E.coli에 Sol I, II, III를 처리하여 세포벽과 세포막을 깨고, 그 외 단백질과 균의 genomic DNA를 제거하고 kit를 이용해 순수하게 plasmid DNA를 분리했고, C.elegans에 위 시약과 유사한 역할을 하는 ATL buffer, proteinase K, AL buffer 등을 통해 단백질, 세포막을 제거하고, 100% ETOH로 DNA를 침전시켜 genomic DNA를 얻었다. 이렇게 순수 분리한 DNA의 size를 알아내기 위해 Agarose gel 전기영동을 실시했다. 전기영동을 하기 전에 cuvette에 100㎕로 맞추기 위해 기계를 통해 DNA 농도를 계산하여 각각 100ng, 200ng으로 dilution시켰다. 이렇게 희석시킨 각 DNA를 1㎕, T.D.W 4㎕, 6x dye 1㎕를 각각 pipet으로 따서 섞은 후 gel에 loading한 후 전기영동을 실시했다. 옆에 있는 그림은 전기영동 한 gel을 EtBr(DNA 염기 사이에 끼어들어가 UV를 통해 형광색으로 염색해주는 발암물질 시약.)로 염색한 결과를 나타낸다. C.elegans의 genomic DNA의 크기(Fig 1. 위, 9, 10번)는 약 1억 bp이고, plasmid DNA(Fig 1, 아래, 7, 8, 9번)는 pBlue Script SK는 약 2.9kbp이고, C44C1.4를 insert한 크기는 약 5kbp인 것을 알 수 있다.

위 실험으로 얻은 plasmid c44c1.4 DNA가 들어있는지 확인하기 위하여 southern blot을 시행했다. 실험하기 위해서 먼저 DNA에 제한효소를 처리하는데 이때 원하는 자리에 자를 수 있고 우리가 원하는 gene을 자르지 않는 제한효소를 선택하여 처리한다. 실험실 EcoRV, Age1을 처리한다. 그렇게 하여 DNA를 확인하는 것이다. Hybridization을 하기 위해 membrain에 transfer한다. 이때 alkalin buffer를 사용하는데 gel의 TAE buffer를 washing하기 위한 것이다. 이 안에 NaOH와 NaCl이 들어가는데 NaOH가 pH가 상승되어 base pair가 떨어져 약간의 dinaturation상태가 된다 그리고 모세관 현상을 통해 gel에서부터 (-)극인 DNA가 (+)극인 membrane으로 transfer하게 된다. transfer한 DNA에 probe를 붙이고 dNTP와 polymerase를 넣어 exposure시켰다. 이 때 넣은 dNTP중 dCTP에 방사선동위원소를 표지하고 UV를 이용하여 찍은 film을 확인하는데, 이 때 UV가 dNTP중 방사선 동위원소를 표지 한 dCTP를 확인하여 촬영을 한 것이다.

plasmid DNA concentration 은 제대로 나온게 아님
학부생실험이니 이해해주셈...ㅋㅋ