SDS-PAGE

실험주제
  Protein analysis by SDS-PAGE

2. 실험목표
  단백질 분석에 강력한 수단이 되는 SDS-PAGE를 실시하기 위해 필요한 SDS-PAG(Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcryamide Gel)을 제조하고, SDS-PAGE를 실시하여 protein을 분석한다.

3. 실험 도구 및 방법
  hand-out 참조

4. 실험 이론 및 원리
  PolyAcryamide Gel Electrophoresis(PAGE)는 분자의 전하와 크기에 의하여 분자들을 분리하는 방법이다. 이 분석 방법에서 protein은 PolyAcryamide Gel에서 전기장의 방향에 따라 이동한다. 염기성 pH에서 electrophoresis를 수행하는데, 이 실험 조건 하에서 모든 protein은 음전하로 충전되어 양극쪽으로 이동한다. 그렇지만 gel은 그물 같은 모양을 가진 체의 역할을 하기 때문에 큰 분자들은 저항을 많이 받으므로 작은 분자들이 빨리 이동하게 된다. 따라서 분자들은 전하와 크기에 의하여 분리된다.
 이번 실험에서는 일반적인 PAGE에서 조금 변형한 SDS-PAGE를 하여 protein의 분자량까지 예측할 수 있다. electrophoresis을 하기 전에 protein을 SDS(sodium dodecyl sulfate)로 처리하는데 이것은 (-)charge를 지닌 계면활성체로서 protein의 분자량에 비례하여 protein과 결합한다. 또 SDS는 protein의 native conformation을 깨뜨려 protein을 linear으로 만든다. 그러면 각각의 protein은 비슷한 형태를 가지며 또한 전하 대 분자량의 비율이 비슷하게 되기 때문에, electrophoresis에 의한 protein 분리는 전적으로 분자의 크기에 따라 이루어진다. 분자량을 알고 있는 몇 가지 proteins를 분자량을 모르는 미지의 protein 즉 우리의 실험에서는 AP(Alkaline Phosphatase)와 함께 electrophoresis하면 AP의 분자량을 대략 가늠할 수 있다.
  electrophoresis가 끝난 후에 gel을 staining하면 protein이 어디에 있는지 찾아낼 수 있다. 아주 정제가 잘 된 protein의 경우에는 gel상에 한 개의 band만 있거나 또는 선명한 band 하나와 어렴풋하게 보이는 여러 개의 불순물 band가 있다.
 이 실험에서는 coomassie brilliant blue로 염색을 하였는데 coomassie brilliant blue은  일차적으로 basic amino acid (arginine etc.)에 결합하고, 이외에 aromatic amino acid와도 binding하는 것으로 알려져 있다. 따라서 비특이적으로 protein과 결합을 해 Electrophoresis된 gel을 staining후 destaining과정에서 protein을 제외한 나머지 부분은 destaining되고 protein은 blue로 남게 되는 것이다.
 Western blotting(Immunoblotting)은 antigenic epitope과 반응하는 antibody를 이용하여 protein mixtures 중에서 원하는 protein(antigen)만을 찾아내는 방법이다. gel이 transfer된 membrane의 특정protein이 있는 부위에만 antibody가 붙게 되고 후에 붙은 antibody에만 붙는 또 다른 antibody를 붙여서 여기에 다양한 발색방법이라든가 필름에 현상 되어질 수 있는 물질을 달아 band를 확인할 수 있다.
 
 
5. 실험 결과
                             
이것은 coomassie brilliant blue로 staining한 결과로 
왼쪽에서 차례대로 marker, 200-1, 125-2, 125-1, 75-2, crude extract 이다.
우측 사진에 yellow box로 표시 되는 부분이 아래의 prestained marker의 information에 따라 우리가 찾는 protein인 Alkaline Phosphatase이며, 이것의 분자량은 57kDa 쯤으로 추정 가능하다.

6. 토의
 이번 실험에서는 protein을 electrophoresis하여 marker를 중심으로 반으로 잘라 crude extract가 포함된 쪽은 coomassie brilliant blue로 staining하고, 또 다른 한 쪽은 western blotting을 하였다.
 staining 결과를 보면 destaining이 매우 잘 된 것을 볼 수 있다. 하지만 marker 부분을 보면 너무 많이 잘려서 marker와는 비교하기가 힘들다. 그리고 gel을 자르고 옮기는 과정에서 아랫부분이 조금 찢어지긴 했지만 이 과정은 분석하는데 큰 영향을 주지는 않는다. 그렇지만 이 과정에서 gel이 찢어지지 않게 조심해야 한다는 것을 배울 수 있었다.
 staining gel에서 band를 보면 crude extract에 비교해서는 분리 정도가 확실히 차이가 나며 상당히 깨끗하게 분리 정제가 잘 되었음을 알 수 있고, 125-2에서 잘 발현이 됐음을 볼 수 있다.
 band를 좀 더 잘 관찰하기 위한 방법으로는 band 사이의 간격을 늘리는 것과 뚜렷한 band의 결과를 얻으면 될 것이라고 생각한다. band 사이의 간격을 늘리는 방법에 대해 생각하다가 처음에는 pH가 밴드의 분리여부에 관련이 있다고 생각하였는데 그것이 아님을 깨달았다. SDS-PAGE에서는 pH가 중요한 인자인데 Running gel, stacking gel, sample buffer, 그리고 running buffer의 pH가 모두 electrophoresis에 영향을 주기 때문에 어느 한 가지 buffer의 pH만 조절한다면 오히려 electrophoresis를 제대로 수행해 낼 수 없기 때문이다. pH 조절이 아닌 gel의 percentage를 조절하면 band 사이의 간격을 쉽게 조절할 수 있을 것이라고 생각한다. 뚜렷한 band를 얻으려면 sample protein양을 적게 하고 stacking gel을 좀 더 길게 만들고 stacking도 조금 더 오래 하는 것이 band를 덜 퍼지게 할 수 있을 것이다. 그렇지만 가장 중요한 것은 loading 과정이라고 생각한다.
 sample을 100℃에서 잠깐 끓이는 이유는 folding되어 있는 protein을 linear하게 바꿔주는  것이다. linear하게 한 뒤 SDS가 붙어 다시 folding이 되지 않게 함으로써 SDS-PAGE를 하였을 때 제 size가 나오게 된다.
 Destaining Solution 을 만들 때 Ethanol을 사용해도 되지만 Methanol을 쓸 때처럼 깨끗하지 않다고 하는데 그 이유는 두 용매의 극성이 아주 다르기 때문이다.
 추가적으로 electrophoresis할 때 아래에서 무엇인가 작은 물질들이 위쪽으로 올라왔었는데 무엇인지, 그리고 왜 그런가 알아보니 chamber내의 백금전서에서 올라온 기포였으며 이는 시간이 지날수록 위쪽으로 걸쭉하게 생기게 된다고 한다.
 그리고 protocol에서는 gel transfer를 할 때 PVDF membrane을 사용한다고 하였는데 실제 실험에서는 Nitrocellurose(NC) membrane을 사용하였다. 이에 의문이 들어 이 둘의 membrane이 거의 비슷한 것이어서 대체해서 사용한 것이라고 생각하고 알아보았더니 PVDF나 NC나 둘 다  protein transfer해서 western blotting할 때 사용하는 membrane인데 PVDF는 NC나 Nylon에 비해 산이나 유기용매에 resistance가 강하기 때문에 N-terminal sequencing과 같은 (edman degradation법) 강한 조건의 실험에서는 반드시 PVDF로 transfer 해야 한다고 하였다. 덧붙이자면 PVDF는 hydrophobic하기 때문에 solubility의 증가를 위해 MeOH과 같은 solution에 담그었다가 사용하고, NC는 단지 buffer에만 적셔도 된다고 한다.
 단순히 실험만 하는 것도 재미가 있지만 실험 과정에서 궁금했던 것을 알아보고 결과를 분석해보고 다른 사람들의 조언을 듣는 실험 후 가 더욱 흥미진진하다. 앞으로도 다만 형식적으로 제출하는 report가 아닌 나를 위한, 나의 내공을 위한 report를 위하여 더욱 노력하여야겠다.

7. 참고문헌
-Rodney Boyer(2007), Concepts in Biochemistry(3rd Ed.), Wiley, p. 85
-David L. Nelson외(2005), Lehninger Principles Of Biochemistry(4th Ed.), Freeman, pp. 92-93
-한국교원대학교 과학교육연구소(2002), 고등학교 생물실험(2nd Ed.), 교육인적자원부, pp. 264-267


sds-page 결과

만들다가 젤이 휘어져서..;;;