데생하는걸로 하도 뭐라그래서 그냥 포토샵으로 mm 1:1  방안지 만든다음에 mm단위로 전개도 칸 만들고

해부학 교과서에 있는 그림 복사해서 선 딴다음에 내부 지워버리고 안걸리도록 연필보다 연하게 색조정해서 인쇄한다음에  연필로 선따라 긋기만 하면 레포트 완성 ㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋ

 

매주 내가만든 이걸로 레포트 쓰는 애들이 15명 ㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋ

내년에 후배들한테 한세트에 100엔씩 팔아야짘ㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋ

 

근데 컴퓨터로 이렇게 정확하게 지시받은대로 배율 맞추고 했는데도 딴지거는 교수가 있음. 사미조 라고.... 할배 맨날 딴지걸엌ㅋㅋㅋ

전원 재레포트때리고... 그다음주에 하나도 안고치고 내면 다른교수는 합격시켜줌 ㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋ

교과서 그대론데 뭐가 문제임 문제라면 교과서가 문제겠지 그럼 문제있는 교과서 쓰는 교수잘못이지 내 잘못은 아니자낰ㅋㅋ

Posted by 찬재

댓글을 달아 주세요

  1. 이승희

    안녕하세요 반가워요

    2016.07.16 03:58 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]
  2. 비밀댓글입니다

    2017.02.22 11:34 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]
    • 저는 카카오톡 못씁니다. 윈도우폰이라서 카카오톡 어플 자체가 없구요, pc용 카카오톡은 모바일인증해야 쓸수있대서 못쓰고있습니다.

      2017.02.25 10:00 신고 [ ADDR : EDIT/ DEL ]
  3. 이은영

    얼마나 걸릴까요?

    2018.08.12 21:08 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]

대학 과제 및 리포트2012. 8. 28. 22:42

 

King Sejong the great.pptx

 

으헤헤헤헿 호평일색이어씀

Posted by 찬재

댓글을 달아 주세요

  1. sephiroth17

    웬 장사꾼이 왠지갓길에서 며칠이고 몇 달이고 궂은 날씨에 상관없이 굳이 그 자리에서만 "떡 팖. 오늘 갓 만듦. 맛있는지 맛없는지 직접 확인하시오."라는 간판을 세워 두고 떡을 파는데, 불법영업이라서 단속반이 좌판을 들어내려 하면 웃통을 벗어 문신을 드러내며 저항하곤 해서 단속의 어려움이 이루 말할 수 없습니다. 이하 내용 없음. 보고 끝.

    http://mirror.enha.kr/wiki/%ED%95%9C%EA%B8%80

    2012.09.03 23:15 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]
    • 횽 무슨말이 하고싶은거예욬ㅋㅋㅋ 링크랑 댓글내용이랑 아무런 연관도 없고 뭐야 무서워 ㅋㅋㅋㅋㅋ

      2012.09.04 00:41 신고 [ ADDR : EDIT/ DEL ]
  2. rebakah14

    ㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋ 뭐지 정말

    2012.09.04 15:01 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]
  3. sephiroth17

    링크 내용에 있는걸 가져다 놓은건데... 음.. 어쨌든 잘쓰고 있긴 하지만 한글 어렵다고..

    2012.09.06 02:58 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]

대학 과제 및 리포트2011. 12. 8. 23:50
핵에너지 계속 사용하여야 하는가? 라는 시험문제가 제출되었음. 아.. 이건 내 발표내용이구나 하면서 신나게 적었음
하지만... 치대로 진로가 결정되버려서 공부를 하나도 안해가지고... 단답형문제는 거의다 틀리고.. 본인생각적는거만 주우욱 신나게 적었는데 교수님께 죄송했음..;;;; 그렇다고 공부안해서 죄송하다고 답지에 적기는 또 뭣하고 해서 그냥나왔는데

호오옥시나 교수님께서 이 글을 보신다면, 전 매우매우 부끄럽고 죄송할 따름입니다. 진로가 벌써 결정나서.... 그것도 전혀 관계가없는 분야다보니 공부할 맛이 안났어요 ㅠㅠ

일본 마지막.pptx

 

소개,

 

환경에 관련된 데이터들은 환경성과 관련 보고서 2, 에너지에 관련된 자료는

아오모리 상공회의소, 후생노동성, OECD 그리고 일본의 미래에너지대책의 선택에 관한

전력공급원에 관한 여섯 가지 시나리오 라는 학술보고서 내용을 참조하였습니다.

 

클릭

 


발표는 일본의 환경과 에너지 그리고 그 대책들, 그리고 마지막으로 현재의 대책들과 상황으로 2021년을 예상해 보는 것으로 발표를 진행하도록 하겠습니다.

 


클릭

 

먼저 일본의 환경 대책의 역사에 대해 발표하겠습니다. 일본에서의 환경 문제는

 에도시대(1603~1868)때부터 공해의 개념으로 존재했고, 지자체 단위로 대책을 시행하고 있었습니다.

하지만 공식적, 국가적 환경대책의 역사는 56년의 미나마타병의 발견을 시작으로 64

공해대책추진연락회의 설치부터라고 할 수 있습니다. 일본은 1950년대, 1960년대에

심각한 공해문제를 겪은 후, 환경정책을 강화해왔고, 71년 환경성이 발족되고 수질오염방지법이나 대기오염방지법에 의거해 수질, 대기의 규제가 강화되어 1970년대부터 1980년대에 걸쳐서는

 오염이 감소해 왔습니다.
1990
년대에는 지구온난화가 매우 중요한 환경문제가 되어, 일본은 재생가능에너지나 에너지절약기술의 보급 등 온실가스를 줄이기 위해 구내대책과 교-토 의정서에 대한 합의 회의 주최 등 기후변화에 관한 국제 합의를 형성하는 노력을 하는 등, 활발하게 활동해 왔습니다.

이 외에도 일본의 환경 정책은 많은 분야에 걸쳐있는데요. 예를 들어, 자연 공원의 관리,

생물 다양성, 화학 물질 관리, 토양 오염, 환경 평가, 폐기물 관리 및 재활용이 환경성(環境省) 책임 하에 있습니다.

 

클릭

 

일본의 수질오염은 긴 역사가 있습니다. 19세기 와타라세강 하류의 주민들은 상류의 구리광산에 의한 오염을 겪었었고, 1956년에는 메틸 수은 중독의 결과로 발생한 미나마타병의 첫 번째 사례가 보고되었습니다. 이 미나마타병은 화학 공장에서 촉매제로 사용된 수은의 부산물인 메틸수은을 폐수로 흘려보내 미나마타 만에 메틸수은이 배출되었고, 배출된 메틸 수은을 박테리아가 섭취하고 이 박테리아를 물고기가 섭취하여 biological concentration 되어 물고기를 많이 먹은 사람들이 결과적으로 피해를 받은 사례입니다..

56년의 미나마타병 발병 이후로도 1960 년대에는 수질 오염 환경 문제는 더욱 악화되었습니다.  진즈강의 카드뮴 오염은 뼈를 약하게 하여 이따이이따이병을 일으켰습니다. 또한 많은 강과 바다와 호수에서 증가한 유기물이 산소를 줄였고, 지역 주민들은 악취, 물고기의 감소, 수중 유독부유생물이나 세균의 증식을 겪었습니다. 따라서 앞서 설명했듯이 수질 오염 방지법이 1970년 입법되었고, 세토 나이 해 환경 보전 임시 조치법이 1973 년 입법되었습니다.

 

클릭

 

그렇게 수질오염의 심각성을 깨닳은 일본은

 

클릭

 

국가와 지방 자치 단체수준에서 수질 오염 방지법, 세토나이 해 환경 보전 특별 조치법, 호수 수질 보전 특별 조치법에 따라 수질 보전에 관련된 규제들과 생활 배수 대책을 세우게 됩니다.

세토나이해 환경보전 임시 조치법은 세토나이 해의 주요 섬인 혼슈와 시코쿠, 규슈 사이의 수역에서 오염 물질의 총량을 규제 하는 법인데, 이 임시 조치법은 1978년 영구 법과 되게 됩니다. 그 외에도 오오사카에서는 주민 등 많은 사람들의 수원인 비나 호수의 오염을 줄이기 위해 1984 년 호수 수질 보전 특별 조치법이 입법됩니다.

클릭

그러한 규제들에 따른 일본의 배수 기준은 2 가지로 구분되어 있습니다. 하나는 사람의 건강에 관한 기준으로 수은이나 카드뮴 같은 질병의 원인이 될 수 있는 오염 물질의 기준이 있고, 다른 하나는 생활 환경에 관한 기준으로, 유기물에 의한 오염을 나타내는 수질의 지표인 생물 화학적 산소 요구량 (BOD)와 화학적 산소 요구량 (COD)가 생활 환경에 관한 기준입니다. (유기물에 의한 높은 수준의 오염은 수중의 산소 부족을 일으킬 수 있다. )

 

클릭

 

요리, 세탁, 목욕 등 생활 폐수는 공공 수역의 오염의 중요한 요소였습니다. 1996년 일본 전국 하수 보급율은 56%였는데, 가정에서 폐수를 처리하기 위해 일본 정부는 하수설비시설 건설을 추진했고, 하수 보급률은 2007년도에는 71.75%가 되었습니다. 나머지 하수가 없는 지역은 주로 산악 지역 또는 인구밀도가 낮은 지역입니다. 하수설비시설이외에도 농업 집락 배수시설이나 가정용 폐수 처리 설비인 정화조가 폐수처리를 위해 개발되었고, 시설 건설 시에는 보조금이 나와 오수 처리 인구 보급률은 1996 62%였던 것이 2007년도에는 83.7%가 되었습니다.

 

또 가정에서 폐수를 줄이기 위해 수질에 대한 정보를 넓혀 국민의 의식을 높이는 노력을 하고 있습니다.
환경성과 지자체는 다양한 출판물과 홈페이지를 만들어 환경 친화적인 물 사용을 호소 해왔고, 국민의 의식 향상과 함께, 세제의 제조 업체는 환경에 악영향이 적은 제품으로 바꿔왔습니다. 예를 들어, 1970 년대에 무인(
無燐) 세제가 개발되어 현재 일본의 대부분의 세제는 무인세제입니다.

 

클릭

 

그리고 이 규정들에 따라 배수 공장 등의 사업장은 배수의 오염 수준을 측정하고 결과를 저장해야 합니다그리고 환경 장관, 주지사, 시장은 필요한 경우 공장 기타 사업장에서 폐수에 관한 보고를 요구, 출입 검사를 할 수 있고만약 배수가 기준에 위반하는 경우 처벌을 집행할 수 있습니다또한 시설의 구조 및 폐수 처리 방법을 변경하는 명령을 내릴 수 도 있게 됩니다.

 

클릭

 

그림에서 볼 수 있듯 이전 슬라이드에서 설명한 대책들이 효과를 보아 대부분의 강과 바다에서 수질이 개선되었는데, 일부 호수는 수질 개선이 미흡했습니다. 따라서 환경성의 호수 연구회는 2004년에 추가적인 대책의 필요성에 합의하여 2005년 호수 수질 보전 특별 조치법을 개정하여, 농업 등의 방면에서 근본적 대책이 추가되어, 법으로 지정된 지역은 질소와 인산이 호수에 유입되는 것을 줄이기 위해 비료 개선이 권장됩니다.

1997년에는 하천법이 개정되어 환경 개선과 보전을 위한 하천 관리 업무를 늘였고하천 국의 "환경에 초점을 맞춘 하천 관리"에 따르면, 수질 개선과 자연 환경 보전을 위해 몇 가지 프로젝트가 실시 되어 일부 댐에서는 에어레이션을 통한 수질 개선을 시행중 이라고 합니다.

 

클릭

 

사람의 건강 관련 항목 즉 납이나 카드뮴 등 중금속 오염에 관한 그래프인데, 앞선 대책들로 인해 70년대의 중금속 오염률이 줄어든 것을 보실 수 있습니다, 그래프에선 2008년도가 나와있지 않지만 환경성에 따르면 2008 년도 환경 기준 달성율은 99.0%라고 합니다. 나머지 기준을 초과하는 1%에 해당하는 지점의 대부분은 인근의 암석 또는 토양의 비소 함량이 높은 등 자연에 기인한 것이라고 합니다.

 

클릭

 

이어서 대기오염입니다.

1960년경 대규모 석유 화학 공장 부근의 특정 지역에서 천식 환자가 증가했습니다. 이는 주변의 대기가 유황 산화물 오염되어 있었기 때문이었습니다.

 

클릭


이 같은 대기 오염 문제를 해결하기 위해 대기 오염 방지법이 1968 년에 입법되었습니다. 이 법은 공장에서 매연과 먼지의 배출을 관리하고 자동차 배기 가스 제한을 설정하는 것 등에 의해 대기의 질을 보전하기 위한 규정입니다.

그 규정에 따라

매연 발생 시설을 만들려고 하는 자는 시설 계획 등의 정보를 제출 하여야 하고예상되는 매연 발생이 환경 기준을 초과한다고 판단되면 계획의 변경을 명할 수 있습니다. 그리고 매연 발생 시설의 관리자는 환경부가 설정한 기술적인 기준에 따라 발생한 매연의 양과 농도를 측정하고 기록을 보존 하여야 합니다만약 오염 발생이 지속적으로 기준을 초과할 가능성이 높다면 관리의 개선을 명하게 됩니다.

클릭

 

그리고 공장에 배기 가스 탈황 장치를 설치하여 대기중 아황산가스 오염을 방지하게 됩니다.

클릭

 

또한 자동차에서 배출되는 질소 산화물 및 입자상 물질의 특정 지역의 총량의 삭감 등에 관한 특별 조치법 시행하게 됩니다.

 

클릭

 

이 특별 조치법은 도로에 인접한 곳에서의 이동원에 의한 대기 오염을 줄이고 대기의 질을 보호하기 위해 법과 되었습니다이 법의 내용으로는 환경 장관은 자동차 배기 에 대한 허용 한도를 표1 과 같이 설정하고환경 장관은 또한, 건설 기계 등 도로 관계 이외의 특정 특수 자동차의 배기 가스에 대한 허용 한도를 설정합니다..

환경 장관은 자동차의 배기 가스에 의한 대기 오염을 방지하기 위해, 필요가 있는 경우, 자동차 연료 품질에 대한 허용 한도를 설정합니다

예를 들면, 경유에 포함된 유황 규제의 추이는 표 2와 같이 강화되어왔습니다.

클릭

 

이러한 대책들이 효과를 거두어 그래프에서 보듯이 1970년대부터 1980년대 초에 걸쳐 대기 중의 이산화황의 연평균 값이 감소되는 것을 보실 수 있습니다. 이 구간은 일본의 공장 배기 가스 탈황 장치의 설치를 급격하게 증가시킨 시기입니다. 1970년도 일본의 배기 가스 탈황 장치의 총수는 102대였지만, 1980년도에는 1329, 1990년도에는 1914대로 증가했습니다. 환경 규제뿐만 아니라, 특히 1970년대부터 1980년대에 걸쳐 환경 투자에 자금 수요가 높은 시기에는 정부계 금융 기관에 의한 특별 회계가 공장 탈황 장치 등의 설치를 촉구했습니다.

 

클릭

 

이러한 조치가 취해진 후 2002 , 1에서 볼 수 있듯이, 일본의 황 산화물과 질소 산화물의 배출원단위는 스위스 다음으로 낮았습니다.
2001
"자동차에서 배출되는 질소 산화물 및 입자상 물질의 특정 지역의 총량의 삭감 등에 관한 특별 조치법"시행 이후 오염은 더욱 감소했다. 2는 특정 지역의 2001 년부터 2008 년까지의 이산화질소 감소를 나타내고 있습니다

 

클릭

 

환경부분의 마지막으로 지구온난화 대책입니다.

클릭

 

1997 년 일본은 유엔 기후 변화 협약의 제 3 회 체약국 회의를 개최했고, 교토 의정서가 합의되었습니다. 교토 의정서는 선진국의 온실 가스 배출을 2008-2012년 사이에 1990년 수준보다 평균 5.2%를 감축하여야 하는 국제협약인데, 일본은 온실 효과 가스를 1990년 대비 6 %를 감축하는 것이 목표입니다.

 

클릭

그리고 환경성은 지구온난화에 관해서 공중의 인식을 높이는 캠페인을 하고 행동을 호소해 왔습니다. 예를 들어 2005년에는 co2를 감소시키는 라이프스타일을 진흥하는 [팀 마이너스 6%] 라 불리는 캠페인이 시작되었습니다. 이는 에어컨의 사용을 줄이고, 에코 드라이브를 권장하고, 섭씨28도에서도 편안하게 일할 수 있는 비즈니스 스타일인 [쿨비즈]를 격려했습니다.

2009년판 환경 순환형 사회생물다양성백서에서도 기후 변화 대책에 강한 강조를 하고 있습니다.

클릭

 

 2008 7 월에 각의 결정된 "저 탄소 사회 만들기 행동 계획"의 정책을 보면 2008년 기준으로 태양광발전을 2020년까지 기존의 10배를 설치하고, 30년에는 기존의 40배를 설치하고, 차세대 자동차 판매를 2020년까지 신차판매의 50%를 차지하는 것을 목표로 하고, 30년까지 항속거리를 500키로를 달성, 에너지 절약 램프를 12년을 목표로 백열전구를 형광등으로 교체하는 정책이 있습니다.

 

클릭

1초 후 클릭

 

인구증가는 필연적으로 에너지 소비를 증가시킵니다. 하지만 일본의 최근 10년간의 인구변화를 보면 07년 이후로 연간 출생 수가 연간 사망 수를 밑도는 상태가 계속되고 있으며 연간 자연 증가 수는 계속 감소하고 있습니다.
일본은 이미 고령화 사회로 볼 수 있으며 점차 인구수가 감소되는 추세이므로 에너지요구량은 더 이상 증가되진 않을 것으로 예상할 수 있겠습니다

 

클릭

 

일본은 GDP 1 단위당 다른 주요 국가 / 지역보다 적은 에너지를 사용하고 있습니다. 에너지 절약은 온실 가스 감축에 도움이 될 뿐만 아니라 높은 에너지 가격에서 경제와 사람들을 보호하는데 공헌하게 됩니다.

 

클릭

 

그리고 이번엔 에너지를 공급하는 수단입니다.

미국은 세계 1위 전력소비국. 석탄, 석유, 천연 가스를 포함한 풍부한 자원 부국이고,

독일은 풍부한 석탄 자원을 배경으로 에너지 자급율이 40%에 달합니다.

프랑스는 화석 연료가 부족한 자원 소국이라 원자력 개발을 주력으로 하고 있어, 일본과 비슷한 모델입니다.

영국은 화석연료가 풍부하고, 60~70 년대 북해생산 천연가스, 원자력 등으로 균형 잡힌 발전을 보이고 있습니다

스웨덴은 풍부한 수력자원개발과 원자력으로 전체 전력 공급을 커버합니다. 화력발전이 거의 없어 co2배출량이 제로에 가깝습니다

중국은 발전전력량의 80%가 석탄, 석탄을 연간 13억톤을 생산하는 세계 제일의 생산국입니다.

그리고 주제국인 일본으로 돌아와 보면 일본의 에너지 생산량은 총1362kWh이고 균형 잡힌 전원을 구성하고 있는데요, 이는 석유위기를 계기로 전력원의 다양화를 추진한 결과로, 원자력, 천연 가스, 석탄, 석유, 수력으로 균형 잡힌 전력원을 구성하고 있습니다

일본은 세계 4위의 에너지 소비국으로 에너지의 대부분을 수입에 의존하고 있어 자급률은 원자력발전을 포함해 20%입니다. 석유 위기를 계기로 탈 석유를 도모하여 원자력을 개발하였으나 지난 3월 원전사고로 인해 원자력 발전은 점점 줄여나가는 추세입니다. 따라서 원전발전에 의한 자급률이 줄어들 것이므로 전력수입량이 더 늘어날 것으로 보입니다. 따라서 차세대 에너지 개발이 시급한 상황이라 할 수 있습니다.

 

클릭

 

지난 3월 동일본대지진에 의한 도쿄 전력, 후쿠시마 원자력 발전소 사고는 국내외에 큰 충격을 주었습니다. 사고는 주민의 피난 생활, 비산하는 방사성 물자에 의한 피폭이나 오염 위험으로 국민 생활에 심각한 어려움을 낳고 있습니다. 따라서 다시 국내외에서 에너지의 선택을 둘러싼 논의가 활발하게 이루어 지고 있는데, 일본 학술 회의는 특히 전력 공급원의 선택을 둘러싼 논의를 하고, 학술적인 근거에 근거한 종합적인 판단을 위해 동일본 대지진 대책위원회 아래에 에너지 정책 선택 분과회를 설치하고 데이터를 수집하고 조사 검토를 진행하여 슬라이드 내용과 같은 후쿠시마 원전 사고 이후의 전력공급원에 대한 6가지 시나리오를 제시 했습니다.

시나리오들을 보시면 원전발전을 즉시 정지하고 화력발전으로 대체하며 순차적으로 재생가능 에너지발전을 도모하는 A를 시작으로 점차 원전을 줄이고 개발을 통해 안전한 원전개발 시나리오들 그리고 원전 중단 없이 원전을 지속적으로 사용하며 원자력발전의 기술개발을 통한 안전성 확보를 목표로 하는 F까지를 보실 수 있습니다. 이로 보아 일본에 있어서 원전이 후쿠시마 사고에도 불구하고 포기하기 힘든 에너지원이라는 것을 알 수 있겠습니다.

 

클릭

 

이번엔 일본이 사용중인 그리고 개발중인 재생에너지기술들인데요, 신 재생 에너지 및 원자력을 포함한 비 화석 에너지는 CO 2 배출 삭감에 공헌합니다. 정부는 신 재생 에너지의 생산과 이용을 장려하고, 2009 11 월 태양광 발전의 새로운 매입 제도를 통해 태양광 발전의 잉여 전력을 일정한 가격으로 매입하는 것을 전기 사업자에게 의무화하였습니다. 예를 들어, 주택 용은 48 / kWh, 비 주택용 24 / kWh에 매입하게 됩니다.

하지만 보시면 재생에너지들은 공통적으로 설치 비용이 비싸고, 에너지 밀도가 희박하고 발전효율이 낮은 치명적인 단점을 가지고 있습니다.

원전 사고 이후에도 원전을 포기하기 힘든 이유가 여기에 있는 것입니다

 

클릭

 

.

이 그림은100 kW 정도의 표준 원전을 재생 가능 에너지로 대체하는 데 필요한 면적을 그린 것입니다. 태양광이나 풍력 같은 재생 가능 에너지 발전설비설치에는 압도적으로 많은 토지를 필요로 합니다. 이것은 태양광이나 풍력은 대기에 떠도는 매우 낮은 밀도의 에너지를 이용해야 한다는 물리적인 한계가 있기 때문입니다.
또한 태양광이나 풍력은 날씨에 따라 발전되는 방법이라 기상 조건에 좌우됩니다.

클릭

발전은 최대수요에 맞춰 공급하는 식으로 가야 합니다. 하지만 그렇게 큰 전력을 저장할 수 있는 배터리는 현재 현실적인 비용으로는 만들 수 없기 때문에 재생 가능 에너지와 같은 불안정한 전력은 단독으로 사용할 수는 없습니다. 도쿄전력에 따르면 태양광 발전 비용의 x배 라던지, 풍력발전설비를 얼마 정도 만들면 모든 원전을 대체 가능하다고 설명을 하지만 기후에 따라 전력 공급 정도가 다른 재생에너지는 필연적으로 화력이나 원자력 발전과 결합해야 할 것입니다. 따라서 재생 가능 에너지와 화력이나 원자력에 대한 비용 비교 및 설비비교는 마치 비용만 들이면 재생 가능 에너지만으로 전원을 조달할 수 있다는 환상을 환기시켜버립니다. 전력 수요의 최대치 보다 발전 용량의 최소값이 더 커야한다 는 점에서 재생 가능 에너지의 단독 이용은 매우 어렵습니다.

그렇지만 원자력발전이 장점만 있는 것은 아닙니다 원자력 발전의 경우 핵폐기물을 처리 하는 데에 필요한 비용을 장기적으로 생각해보면 태양광발전에 필요한 비용보다 적은 문제가 있습니다.

 

클릭

 

그래서 제가 생각하는, 그리고 요즘 일본및 전세계적으로 다시 화제가 되는 차세대 대체에너지인 토륨을 사용한 원전을 소개하겠습니다.

클릭

먼저 토륨은 납보다 흔한 금속입니다. 매장량은 우라늄의 4배에 달합니다.

클릭

그리고 토륨 1톤은 우라늄 200, 석탄 350만톤에서 생산하는 전력과 같아 고효율 에너지원입니다. 이미 알려진 토륨원소 비축량은 최소 1만 년 동안 지구에 에너지를 제공할 수 있을 정도라고 합니다. 또한 기존원전에 비하여 설치비용도 저렴합니다.

(미국이 전세계 토륨 매장량의 거의 80%를 차지하고 있다. )

클릭

토륨이 우라늄 233으로 변하고 방사선을 내뿜는것은 똑같지만 폐기물이 기존 우라늄 방식에 비해 1%이하로 발생하고 폐기물은 200년정도만 관리하면 되니 앞서 설명한 폐기물관리에 드는 비용문제는 훨씬 덜합니다. 게다가 멜트다운 할 위험도 없으며 더구나 플루토늄이 생성되지 않아 핵무기의 위험도 없어집니다. 사실 지금껏 토륨원전에 관심이 없었던 것은 플루토늄이 생산되지 않는 점이 컸다고 합니다.

클릭

 

또 토륨은 우라늄과 달리 자체적으로 핵분열을 일으키지 않아 연쇄반응이 나오지 않기 때문에, 원자로 스위치를 끌 경우 토륨은 핵분열을 자동으로 멈춥니다. 따라서, 후쿠시마 원전 사고와 같이 냉각장치 고장으로 인한 사고가 발생하지 않게 됩니다.

인도는 2012년 최초의 토륨원전을 착공하여, 이 원전을 해외에 수출할 계획도 가지고 있다고 합니다

클릭

그리고 소형화가 용이하여 현재 자동차의 동력원으로 사용하는 것을 연구, 검토도 하고 있습니다

상용화 되게 되면 자동차를 기준으로 100년간 충전 없이 달릴 수 있을 정도라고 하네요.

물론 각 자동차마다 핵발전을 하는 셈이니 자동차 사고가 일어날 경우를 생각하면 먼 훗날의 이야기가 될 지도 모르지만, 기존 원전을 대체 할 수 있는 에너지라는 점에선 연구할 가치가 있는 에너지원이라 생각됩니다.

 

클릭

 

마지막으로 2021년을 예상해 보면 에너지 부분에서는 원전사태 이후 점진적 원전가동중지에 따른 대체, 재생 에너지 개발을 추진해야 할 것 입니다. 하지만 이는 저효율 고비용이므로 에너지 절약이 필수적이게 될 것 입니다.

환경부분에서는 여러 규제들과 대중화되어 있는 환경보호 의식으로, 환경 오염상태는 지금과 동일하거나 더 나아질 것으로 예상됩니다.

그러나 원전사고에 의한 태평양 방사능 오염에 따른 수산자원의 피폭과 후쿠시마 인근의 벼, 축산물이 피폭되어있으므로 장기간에 걸쳐 영향이 있을 것으로 예상됩니다.

 

 

Posted by 찬재

댓글을 달아 주세요

대학 과제 및 리포트2011. 10. 17. 09:51

환경보호 ----> 개발은 했으나(개발가능) 나무나 풀 등을 심어서 최소한의 보호를 한다.

 

환경보전 ----> 개발가능구역이기는 하나, 최대한 보호하여 인근지역 생태계에 미치는 영향을 최소화한다.

 

환경보존 ----> 개발불가, 개발자체를 안해 환경적인 부하가 없게한다.(자연상태)

 

 

환경보존 >>> 환경보전 >>> 환경보호

 

Posted by 찬재

댓글을 달아 주세요



 

소포체의 폴딩되지않은 단백질 반응(ER UPR)에서의 신호통합기전

진핵세포에서의 분비,막관통단백질은 ER내강에서 폴딩, 성숙된다. 단백질이 ER로 들어가는 유량은 세포 분화, 환경조건과 세포의 생리적 상태에 따라 가변적으로 변화한다. 이러한 역동적 변화를 조절하기 위해 세포는 ER 의 단백질 폴딩 능력을 조절하여 세포표면과 분비단백질의 품질을 높은 적합도로 유지한다. 이러한 항상성 조절은 effectors ER내강에 직면하는 센서를 가진 신호전달과정을 통해 이루어진다. 이러한 조절의 신호전달경로를  unfolded protein response(UPR) 이라 한다.

 

UPR의 원리

 단백질 합성, 전좌의 저하로 인한 ER로 들어가는 단백질 로드의 감소 - 폴딩되지 않은 단백질 조절을 위한 UPR 타겟유전자의 전사 활성, ER 용량 증가 의 순으로 이루어 지고, 항상성이 재안정되지 않으면 마지막 매커니즘인 세포사가 유발되어 잘못폴딩된 단백질로부터 유기체를 보호한다.

 

UPR IRE1, ATF6, PERK에 의해 매개된다.

 

1) IRE1 매개 UPR

 

 

 

 

UPR은 ER 단백질 폴딩환경을 감지하고, 번역, 전사기관과 상호작용하는 ER transmembrane protein에 의해 개시된다. stressed cell의 막에서 IRE1 oligomerize한다. 세포질의 키나아제 도메인의  Trans-autophosphorylation IRE1을 알로스테릭하게 활성화 시키고 휴면 endoribonucleolytic 활성을 unmask 시키는 nucleotides (N) 친화도를 증가시킨다. 인산화된 oligomerized IRE1  싱글로 알려진 mRNA(X-box binding protein-1 (XBP1), 고등 진핵생물에서는 효모의 HAC1 (homologous to ATF/CREB1) IRE1 연관 시퀀스 특이적으로 작은 RNA 조각(intron)을 잘라낸다. 코딩 시퀀스의 frame shift를 리드하는 mRNA의 양 끝은 묶여진다. 접착된 XBP1 mRNA는 강력한 전사 활성제 (XBP1s) 인코딩한다. 반면 접착되지 않은 XBP1 mRNA UPR의 억제제인 XBP1u를 인코딩한다.

 IRE1 은 대체수단으로서 작동 할 수 있다. 포유류에서 세포내 신호전달 변경과 Jun N-terminal kinase(JNK)에의 신호를 허락하는 phosphorylate IRE1에 의해 TRAF2(tumour necrosis factor receptor (TNFR)-associated factor-2) recruitment 된다. (예를 들자면, 인슐린 저항의 결과) IRE1/TRAF2 complex caspase-12 활성과 세포사에 연관되어 있다. 세포에서 활성화된 IRE1은 다양한 ER-localized mRNA 절단과 그들의 저하(their degradation)을 촉진 할 수 있다. 이 저하는 stressed ER의 로드를 줄이고 ER-associated protein 합성과 전좌를 용이하게 할 수 있다.

 

ER stress  어떻게 감지되는가?


inositol-requiring protein-1 (IRE1) ER에서 perturbed 단백질 폴딩에 관계된 oligomerizationinduced 활성을 시키는 효소인 protein kinase RNA (PKR)-like ER kinase (PERK) ER stress transducer 이다. IRE1 PERK ER 내강에 위치한 폴딩되지 않은 단백질을 감지하는 도메인을 가지고 있다. 이 도메인이 어떻게 폴딩되지 않은 단백질 로딩을 감지하는지는 3가지 모델이 알려져있다. 직접 인식 모델은 폴딩되지 않은 단백질이 IRE1 PERK 의 내강도메인에 직접 바인딩한다. (패널 a)

 

 IRE1(그리고 PERK)에 의한 펩티드 바인딩의 가능성은 펩티드 바인딩이 oligomerization을 유도한다는 것을 제시한다. 다른 모델인 간접 인식 모델은 binding of the abundant ER chaperone immunoglobulinbinding protein (BiP) IRE1 PERK를 비활성상태로 잡는다 ( 패널 b).

물론 unstressed 상태에서는 BIP를 포함한 두 단백질 모두 복합체이다. ER stress는 억제된 복합체의 분리와 PERK IRE1를 활성화 복합체로 결합하는데 관련되어있다. 또한 BiP 과도발현은 PERK IRE1 활성을 현저히 줄이고, unfolded protein response (UPR) 억제한다. 반면 Bip 수준의 감소는 UPR을 활성화 한다. 페널 b 의 모델에서 IRE1 PERK 의 내강 도메인과 BiP의 바인딩은 활성화를 억제한다. 하지만 간접 인식 모델은 어떻게 BiP high mlar ratio stress transducer UPR 민감도의 BiP 클라이언트 레벨(폴딩되지 않은 단백질에서)의 미묘한 변화를 받아들이는지(reconciled)는 밝혀져 있지 않다. 또한 BiP 바인딩은 IRE1 조절에 필수적이지 않다. 세번째 하이브리드 인식 모델은 BiP 분리와 센서 활성에 의한 펩티드 바인딩을 제안한다. (패널 c)

 

2) ATF6: UPR regulated proteolysis

 

ATF6 ER 내강 안에서 stress 감지 부분을 가진다. unstressed cell 에서는 ATF6 CREBH ER membrane에 있다. ATF6 이동(trafficking) binding of the ER chaperone immunoglobulinbinding protein (BiP) 에 의해 저해된다.ER stress 상황에서 ATF6 ER에서 골지체로 운반되고, 골지체 상주 프로테아제에 의해 절단된다. 먼저 S1P(site 1 protease)에 의해 절단된다. 그리고 막내부위치에서 cytosolic DNA-binding portion ATF6f(f fragment)을 분리 하기 위해 S2P(site 2 protease)에 의해 절단된다. 분리된 ATF6f는 유전자 발현을 활성화하기 위해 핵으로 움직인다. ATF6 단백질의 규제된 세포막내 단백질가수분해는 sterol response element binding proteins 와 공유된다. 두 경우 모두, 단백질가수분해 단계에 앞서 비활성 전구체가 골지체로 유통된다. 하지만, 두 클래스의 단백질은 다른 개시 신호로 유통(trafficking)된다. SREBP의 경우엔 스테롤 억제로부터 시작되지만, ATF6의 경우엔 ER의 폴딩되지 않은 단백질의 증가로부터 시작된다. 이러한 증가는 ER에서 골지체로 이동된 ATF6 단백질의 내강 도메인에 의한 직접 또는 간접적(샤페론 매개) 폴딩되지않은 단백질 감지도 증가한다. ER stress BiP ATF6( 그리고 CREBH)와의 바인딩을 중단시키고 ATF6 CREBH를 골지체로 전달되게 한다.  CREB-hepatocyte(CREBH)와 같은 단백질은 최근 ER-stress regulated proteolysis 에 의해 활성화 된다는것이 밝혀졌다. 그러나 CREBH는 분비 패스웨이(secretory pathway) 용량을 증가시키는 유전자를 활성화 시키지 않고, 오히려 ER stress 에서 간에서 염증과 관련된 혈청단백질을 분비하게 한다. ATF6 UPR 타겟 유전자를 활성화 하는 것으로 보인다. 반면 CRENH는 염증과 관련된 단백질을 인코딩하는 급성기 유전자를 활성화 하는 것으로 보인다.

 

3) PERK와 번역 조절

 


PERK는 표면적으로 IRE1과 유사하다. 둘 다 ER에 위치한 내강 stress를 감지하는 도메인과 기능을 가진 실험적으로 서로 바꿀 수 있는 타입1 막관통 단백질이다. PERK의 세포질 부분에서도 ER stressed cell oligomerization에 의한 trans-autophosphorylation undergoes 하는 단백질 키나아제 도메인을 포함한다. 그러나 IRE1과는 다르게 PERK의 기질은 PERK 자신이고, PERK Ser51 에서 eukaryotic translation initiation factor-2 (eIF2
α)α-subunit 을 인산화시킨다. 이 인산화는 elF2 active GTP-bound form 으로 recycle 하는 펜타머 복합체인 guanine nucleotide exchange factor eIF2B를 억제한다.낮은 수준의 번역개시의 결과로 나타난 낮은 레벨의 활성 elF2 은 새롭게 합성되는 단백질 로드를 줄이는 역할을 하고 stressed ER 내강으로 들어가게 된다. ER load 를 줄이기 위한 global protein 합성의 감소의 결과로 PERK-mediated eIF2α인산화는 UPR의 전사적 활성에 기여한다. PERK를 녹아웃 시킨 ER-stressed 세포의 발현분석은 normal UPR에 관계된 수많은 mRNA의 결함을 유도하는 것을 보여준다. 비슷한 stress 유발된 유전자 발현의 결함은 eIF2α
Ser51Ala 돌연변이가 일어난 세포에서도 발견되었다.
가장 중요한 것은 PERK 의존유전자 발현 프로그램은 eIF2
α인산화를 필요로 한다는 것이다. 세포가 생존하기 위해서는 phosphorylated eIF2α 레벨의 조절이 필요하다는 의심의 여지는 있다. ER stress에 의한 PERK 활성화는 빠르게 되돌아올 수 있고, 몇분안에 ER 항상성을 복구하고, 활성화된 PERK는 탈인산화 된다.두가지 밝혀진 유전자 GADD34(growth arrest and DNA-damage inducible protein-34) CReP (constitutive repressor of eIF2a phosphorylation) eIF2α를 독립적으로 dephosphorylate 하는 두 가지 phosphatase complexes를 타겟으로 하는 기질을 인코딩 한다. CReP는 본질적으로(constitutively) CReP를 발현하고 baseline eIF2α 탈인산화에 기여한다. GADD34 eIF2α 인산화에 의해 활성화된 유전자 발현 프로그램의 일환으로 유도되고 그 안에서 작동하는 음성 피드백 루프에 역할을 한다.(serves).

 

PERK membrane 면에서 oligomerizes 되고, 활성화 루프의 trans-autophosphorylation에 의해 활성화된다. 대형 키나제 insert loop의 광범위한 추가 인산화는 기질의 recruitment를 촉진한다.단일로 알려진 기질인 Ser51에서의 eukaryotic translation initiation factor-2 (eIF2)α subunit의 인산화는 elF2가 활성 GTP-bound 가 됨으로서 pentameric guanine nucleotide exchange factor eIF2B 를 억제한다. elF2B와 활성의 저하와 elF2 복합체는 PERK 활성에 의한 결과를 설명해준다. 왜냐하면 다른 elF2 키나제(PKR, haem-regulated inhibitor kinase (HRI) and general control non-derepressible-2 (GCN2))는 이 패스웨이 독립적 ER stress를 활성화 될 수 있고, unfolded protein response (UPR)는 통합적 stress 반응(integrated stress response) 으로 규정된다.낮은 global protein 합성은 ER의 폴딩되지 않은 단백질 로드를 줄이지만 유전자 전사에도 영향을 미친다. 예를 들면 activating transcription factor-4 (ATF4) 의 번역은 elF2가 제한된 상황에서 증가된다. 반면 nuclear factor κB (NFκB) post-translationally 활성화된다. ISR 는 아미노산 트랜스포터와 oxidative stress로부터 보호하는 유전자를 인코딩하는 유전자를 활성화 한다. 그리고 ISR XBP1의 전사 활성에 기여한다.전사 인자 CHOP(C/EBPhomologous protein) elF2α dephosphorylates시키고 단백질 폴딩의 이황화 결합 구조에 필수적인 ER oxidase-1 (ERO1) ISR77에서의 신호전달을 종결시키는 phosphatase PP1 의 조절기질인 GADD34(growth arrest and DNA damage-inducible protein-34)를 포함하는 ATF-4와 표적유전자에 의해 전사적으로 활성화 된다. 구성적인(constitutive) phosphatase CReP (eIF2α 인산화 억제의 constitutive) task41 GADD34 를 돕는다



 

stress 에 의한 ER 개조

다른 세포타입과 다른 생리적 상태에서의 폴딩되지 않은 단백질 로드는 ER의 크기와 관련이 있다.
생리적 요구에 따라 ER이 확장되는 데 UPR이 기여를 한다는 증거가 제시되었다
.
첫 번째 힌트는 UPR 센서가 폴딩되지 않은 단백질과 ER 내강의 샤페론 사이의 불균형에 반응 한다는 놀라운 발견이었다
.
UPR
은 아미노산 import와 샤페론에 의한 폴딩되지 않은 단백질 완충 복원의 측면에서는 이해 되지 않는 tRNA charging과 같은 과정을 활성화시킨다
.
아미노산 트랜스포터는, 예를 들자면, PERK-mediated eIF2
α 인산화에 의해 활성화된 UPR 타겟유전자에 의해 인코딩된다.
그들의 활성은 샤페론과 폴딩되지 않은 단백질의 벨런스에 위협을 가할 수 있다. 왜냐하면 그들은 지속적으로 ER에서의 폴딩되지 않은 단백질 합성을 촉진하기 때문이다
.
이러한 연구결과는 제한적으로 ER stress에 대항하여 방어하기 보다는 세포밖으로의 단백질 분비능력을 증가시키는 UPR의 폭넓은 기능을 나타낸다. 그러므로 UPR은 세포를 ER stress에서 보호하고, 여러가지 메커니즘을 사용하여 ER을 개조시켜 분비용량을 증가시킨다.

 

번역과 전사의 리프로그래밍

PERK-mediated eIF2α 인산화에 의한 번역개시율의 감소는 ER stress 과정에서 가장 먼저 일어나는 일들 중 하나이다.
ER
에서의 로드가 줄어듬에 따라 eIF2
α 인산화는 리보솜과 mRNA의 번역인자를 해방한다(liberates). 그리고 자유 기질(free subunit)을 축적한다. 이 번역 프로그램의 리셋팅은 번역 인자 제한을 위한 UPR 유도 유전자 발현 프로그램에 의해 전사된 새롭게 합성되는 mRNA를 도울 것으로 예측된다. ER에서의 로딩 감소에 따라 eIF2α인산화는 리보솜과 mRNA로부터 유래된 번역인자를 해방한다. 그리고는 자유기질로 축적된다. 이 번역 프로그램의 재설정은 번역인자의 제한적 경쟁이 일어나도록 하는 UPR유도 유전자 발현 프로그램에 의해 새롭게 합성된 mRNA를 도울 것으로 예측된다.
ER translation
의 리프로그래밍은 ER stressed 세포에서의 분비단백질을 인코딩하는 mRNA가 선택적으로 저하되는 것과 연관이 있는 것으로 확인되었다
.
.
수많은 분비단백질을 인코딩하는 mRNA는 야생형과 XBP1 녹다운시킨 ER-stressed cell에서 저하되었고, IRE1가 부족한 세포에서는 저하되지 않았다. 추가실험은 ER membrane과 물리적으로 연관된 mRNA의 서브셋에서 저하가 일어나는 것을 보여준다. 이 분비단백질을 인코딩하는 mRNA의 선택적 저하는 ER 로딩이 감소되고 리보솜과 ER레퍼토리의 리프로그래밍을 유도하는 번역인자를 해방할 것으로 예상된다
.
IRE1, ATF6
PERK 패스웨이에 의한 샤페론 인코딩 유전자의 유발(induction)은 목적이 mRNA 번역 억제 와 엇갈리는 것으로 보인다
.(cross-purposes)

지질과 UPR

전사적 그리고 번역적 리프로그래밍은 ER과 다른 분비패스웨이에서 기능을 하는 단백질의 합성을 향상시킨다.
그러나, UPR은 역시 세포의 세포막의 지질구성요소의 확장에 기여한다. 효모에서, lipid biogenesis의 많은 key rate-limiting 효소를 인코딩하는 유전자들은 UPR 유도에 따라 upregulate 된다.UPR 신호전달이 충분한 경우 의미 있는 분비전담세포에서의 ER의 확장을 유도한다.

 

포스포리피드의 고갈은 UPR을 활성화 한다.

흥미롭게도, 동물세포에서의 지질의 양을 감지하는 주요 패스웨이를 조절하는 SREBP 역시 ER커넥션과 machinery 활성 요소 공유를 통해 조절된다.

비조절된 XBP1은 콜레스테롤 축적을 증가시키지 않는데, 이는 UPR sterol-poor ER membrrane의 증가시키는 것과 일치한다.
UPR
과 스테롤활성신호전달과정은 서로 대비된다. : ER막의 콜레스테롤 축적은 ER stress를 촉진하고 UPR을 활성화하고, 더불어 PERK 연관 eIF2
α 인산화는 SREBP 활성을 방해하고, ATF6 SREBP2를 방해한다고 보고되었다. 알려지지 않은 메커니즘에 의해 비만이 adipocytes와 간세포의 ER stress 를 증가시킨다는 것은 보고되어 있다.포유류에서 IRE1이 인슐린수용체의 다운스트림 신호전달을 억제하는 JNK를 활성화 시킨다
이 분자 매커니즘의 잠재적 생리학적 중요성은 비만 쥐의 인슐린 신호전달이 단백질 폴딩(화학적 샤페론)을 통해 ER stress가 개선되는 것이 상당히 향상되는 실험이 뒷받쳐 준다. 이러한 자극적 연구는 비만 연관 인슐린 저항성의 development에서의 ER stress 2형 당뇨를 연관시켜준다.

 

 

잘못 폴딩된 단백질의 제거와 손상된 ER


ER key
유전자를 포함한 UPR의 타겟은 ER-associated protein degradation (ERAD)를 포함한다.
ERAD
는 프로테오좀에 의한 감성(degradation)을 위해 ER내강에서 시토졸로 폴딩되지않은 단백질의 역전사를 매개한다
.
따라서 ERAD는 다른 UPR 타겟을 잘못폴딩된 단백질을 ER로부터 제거함으로써 보완한다.- 샤페론과 단백질 수정 효소(단백질 폴딩을 촉진하는 업레귤레이션)- 그러나 ERAD 패스웨이로 들어가는 단백질은 세포막을 반대로 횡단한다.폴딩되지 않은 체인은 세포막의 단백질 이동 채널을 통과한다.이 과정에서, 세포소기관은 구성단백질의 크기나 폴딩 상태에 관계없이 degraded될 수 있다. 많은 자식작용과 연관된 요소는 UPR 타겟 유전자로 판명되었고 ER stress로부터 세포의 생존에 중요하다는 것이 최근 밝혀졌다. 따라서 세포가 증가된 단백질 폴딩 로드를 조절하기 위해 더 많은 ER을 생산하고, 이는 부수적으로 세포소기관의 degrade와 손상된 단백질을 대비한다
.
흥미롭게도, 세포UPR 유도 자가소화작용 동안 ER 세포막은 선택적으로 격리되고 autophagosomes로 정확하게 포장된다
.
이러한 이유로, 그 과정은 ER-phagy(ER eating')라고 명명되었다. 손상된 ER의 격리는 ultimate degradation보다 중요하다. 메커니즘은 ER stress 수준을 줄이는 것을 목표로 한다는 것을 설명한다. 그러나, stress가 압도적일 때는 세포사 패스웨이가 활성화 된다.

 

ER-stressed 세포의 생존과 죽음

ER stressed
세포의 폴딩되지않은, 잘못폴딩된 단백질은 독성 잠재력이 주어진다. ER의 칼슙이 세포사의 원인이 되는 세포질 프로테아제의 활성화에 관련되어 있을 수도 있다. 그러나 ER stress가 어떻게 칼슘 누출을 촉진하는지는 알려져 있지 않다. 마찬가지로 ER stress는 미토콘드리아로 신호전달 하거나 세포질에서 활성화되는 caspase-12를 통해 신호전달을 하는 BAK BAX와 같은 다양한 세포사 효과기의 활성화와 관련되어 있다. 그러나 ER에서의 단백질 폴딩의 미세한 면화와 세포사 패스웨이의 활성화 사이의 링크는 잘 알려져 있지 않다.치명적 ER stress와 극복 가능한 ER stress(세포사로 이어지지 않는)가 같은 패스웨이를 활성화시킨다는 유효한 증거가 제시한다. 낮은 수준의 ER stress를 직면했을 때의 생존은 CHOP GADD34와 같은UPR 유도된 세포사 매개자의 내재적 불안정(intrinsic instability)에 의해 촉진된다. 이 모델에 따르면 단백질 수준은 장기적이고 심각한 ER stress 직후에 death threshold를 초과한다.
PERK
연관 eIF2
α 인산화의 완전한 손실은 ER로부터 세포사를 민감하게 한다. 그러나 모든 UPR의 효과기가 보호에 기여하는 것은 아니다. 주목할 만한 예외는 eIF2α phosphorylation에 의해 스스로 전사적으로 유도되는 전사인자 CHOP이다. 조절되지 않은 CHOP 발현은 세포사를 촉진한다. 반면 CHOP 삭제는 ER stressed 세포의 죽음을 막는다. 이 관찰은 CHOP가 세포사가 일어나는 대처 불가능한 수준의 ER stress를 발달시킨다는 것을 나타낸다.  CHOP GADD34를 활성화하고, CHOP-/- 세포의 감소된 수준과 인산화된 eIF2α의 지속적인 상승, 지속적 전사의 억제, 더낮은 수준의 폴딩되지 않은 ER 단백질과 더 낮은 수준의 ER stress와 관련되어 있다. 이러한 보호 메커니즘의 유지에서 GADD34 삭제도 ER perturb 단백질 폴딩을 유발하는 약물에 의한 죽음으로부터 보호한다.
그러므로 인산화된 eIF2
α 에 대한 CHOP 종속 GADD34 연관 음성 피드백은 stressed 세포에서의 ER load의 과도한 회복을 촉진하기 때문에 몇몇 상황에서 부적응 될 수 있다.
선제 eIF2
α 의 인산화와 elF2 발현을 줄이기 위한 유전자 조작(따라서 인산화의 효과를 모방함)은 이후의 ER stress에의 노출로부터 세포를 보호했다.  예를 들면, CHOP 삭제가 도파민으로 활성화되는 뉴런을 ER stress와 관계가 있는 파킨슨병 모델에서의 독성 효과로부터 보호한다. 또한 CHOP 삭제는 당뇨병에서의 인슐린을 생산하는 β세포를 잘못 폴딩된 인슐린으로부터 보호한다. 이러한 예들은 미묘한 균형에서의 한 측면만을 보고한 것일 것이다.; 다른 상황에서는 eIF2α 탈인산화와 단백질 합성의 회복 GADD34 피드백루프가 세포의 생존에 기여하는 높은 PERK 활성 수준을 유도하게 된다. 또한 바이러스 감염에서 상승된 eIF2α 인산화는 세포사멸을 유도함으로써 유기체의 생존에 기여를 할 것이다.

 CHOP(그리고 GADD34)의 활성의 한계는 다른 관련성이 높은 상황에서 부적절하게 낮게 설정될 수 있다. 희귀병인 대뇌 수초형성부전을 동반한 소아실조증은 매우 흥미로운 eIF2α 과인산화의 잠재적 부작용 예시를 제공한다. 알려진 질병유래 돌연변이는 eIF2복합체를 활성화 시키는 구아닌 뉴클레오티드 교체인자 elF2B 활성 감소에 의해 상승된 eIF2α 인산화 수준의 효과와 유사하다.

 

그림5


ER stress와 세포사

 

Altered calcium 조절이 death effectors BAX BAK ER에서 미토콘드리아로 이동시키는데 관련되어 있을 것이고, 쥐에서 caspase-12 활성화(아마도 tumour necrosis
factor receptor (TNFR)-associated factor-2 (TRAF2)
를 통해)는 세포사의 원인이 된다. Inositolrequiring protein-1 (IRE1)연관 Jun N-terminal kinase (JNK)의 활성화는 항 세포사멸 조절자 BCL-2의 인산화와 불활성화에 의해 세포사에 기여할것이다. pro-death 단백질 BAX BAK와의 복합체형성은 IRE1 활성화를 도울것이다. Protein kinase RNA (PKR)-like ER kinase (PERK)연관 eukaryotic translation initiation factor-2
α (eIF2α) 인산화는 pro-survival 단백질의 합성을 억제함으로써 세포사에 기여할 수 있다.; PERK 다운스트림 타겟중 하나인 전사인자 CHOP BCL-2 발현을 억제 할지도 모른다.
대부분의 경우, PERK 신호전달은 세포사에 대항하여 보호한다. CHOP 녹아웃은 UPR반응이 단백질합성의 회복과 eIF2
α의 탈인산화를 촉진하는 음성피드백루프 역할을 설명한다.

 

box 2 암과 UPR

악성 변환과 종양환경은 ER stress를 촉진한다. 종양국소빈혈이 그 메커니즘의 하나이다. 왜냐하면 ER 단백질 폴딩은 ATP를 필요로 하고, intracellular glucose의 감소에 민감하기 때문이다. 암에서의 높은 돌연변이는 단백질폴딩에 의한 ER stress에 기여 할 수 있고, 종양 생존은 유전적 결함을 완충하기 위한 샤페론 수준 조절 신호전달에 의존하는것으로 예측된다.
UPR
은 다양한 인간 종양에서 활성화한다. 일반적으로 solid tumour 에서 발생하는 저산소증은 kinase RNA (PKR)-like ER kinase (PERK)의 강력한 활성제이고 PERK의 다운스트림 타겟이며, transcription factor-4(ATF4)를 활성화 한다. 몇 가지 실험은 UPR이 종양 생존에 기여함을 보여준다. 일부 ER 샤페론 immunoglobulin-binding protein (BiP)이 녹다운된 인간섬유육종세포는 종양처럼 성장하는 능력을 잃는다. 대조적으로 누드마우스에서의 PERK 녹아웃은 Ras transformed 마우스 섬유아세포가 종양처럼 성장하는 능력을 compromise한다. 마찬가지로, XBP1 녹다운은 누드마우스에서의 이식 가능한 종양의 성장을 compromise한다. 또한, 이러한 관찰은 암 치료를 위한 UPR의 방해의 잠재적 효용을 제시한다.

 

결론 및 향후 방향

 IRE1 PERK arms의 패스웨이의 업스트림 신호전달 구성요소는 단백질 키나아제 이기 때문이다.; 그러므로, 그들의 선택적 타겟 약물을 발견할지도 모른다.UPR은 세포 분비기관의 용량증가와 ER로드 감소에 의한 정상과 비정상적 수준의 ER stress로부터 세포를 보호한다. 각 세포들은 다른 수준의 ER stress에 대한 민감성을 가지고 있을 것으로 예측된다.  따라서 PERK IRe1을 억제하는 다른 수준의 관용을 보일 것이다. 다양한 인간 질병들은 필수막 또는 분비단백질 발현을 감소시키는 돌연변이에 의해 발생한다. 많은 그러한 돌연변이들이 폴딩과 단백질기능에서의 관용될 수 있는 미묘한 효과를 가지고 있다는 사실에도 불구하고 돌연변이는 ER의 돌연변이 단백질의 유지와 저하에 충분히 심각한 원인이 된다. UPR은 직접적으로 샤페론의 발현을 조절하고 폴딩을 시도하는 ER 품질관리시스템을 구성하는 저하 machinery를 조절한다. 그러나 궁극적으로는, UPR은 대부분의 그러한 돌연변이 단백질을 파괴한다.

 

 

Posted by 찬재

댓글을 달아 주세요

  1. sephiroth17

    세미나 교수님 누겨...

    2011.06.10 16:52 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]
  2. sephiroth17

    그 교수님 모임은 다들 비슷비슷 한 논문을 내주네...

    2011.06.10 17:17 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]
    • 교수님 전공이 er stress라던데요 ㅋ
      그나저나 논문하는거 저뿐인데
      혹시 수업때 발표도 이걸 주셨나옄ㅋㅋㅋ

      2011.06.10 17:34 신고 [ ADDR : EDIT/ DEL ]
  3. sephiroth17

    아니... 정헌택 교수님하고 술마시러 가는 교수님들은 처음 들어가면 다 거기 관련된 논문을 줘...

    2011.06.10 23:50 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]
    • 요즘 대세가 ER stress 인가바요 ㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋ

      2011.06.10 23:57 신고 [ ADDR : EDIT/ DEL ]
  4. sephiroth17

    줄기세포 공학 9강
    The stochastic model
    The hierarchy model
    좀 설명해주겠나?

    2011.06.10 23:51 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]
    • stochastic model 은 암될껀수가 있는놈은 기회만 잡으면 바로 암되는거구요 hierachy model은 암될 껀수가 있는 놈이 단계별로 암으로 진행되서 고르고 골라서 암세포가 된다는 모델임돠.

      2011.06.10 23:56 신고 [ ADDR : EDIT/ DEL ]
  5. sephiroth17

    땡스

    2011.06.11 00:09 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]
  6. 타도세피로스

    와 찬재 역시 영재 였네 ㅋ 나 누구게?

    2011.06.15 15:03 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]
  7. 타도세피로스

    세필이는 그릴터의 오타구이다 ㅋ

    2011.06.15 15:09 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]
  8. 천재걸

    제 블로그 임여 ㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋ

    2011.07.09 08:53 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]
  9. 천재걸

    이제 모든 08 3학년들이 니 블로그를 들어오겠거니 싶어서 봤더니 ㅋㅋㅋ 3학년건 발생학실험이랑 분자생물학실험밖에 없네 ㅋㅋㅋㅋㅋ 걔들 그거 아에 수업과정에도 없던데..ㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋ

    2012.02.27 21:43 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]


 


 광견병은 4000년 이상 인류가 두려워 했지만 아무런 대책 없이 방치되어 왔던 감염성 질병이다.

광견병이 처음 알려졌을 때, 광견병은 감염에 의한것이 아니라고 인식되엇고, 그저 미친개에게 물렸을 때 물린사람의 죽음은 개 주인에게 물었었다. 그러나 1802년, George Zinke는 광견병이한 종류의 동물에서 다른 종으로 전이되는 것을 처음으로 설명하였고, 1885년, Pasteur는 광견병에 걸린 토끼의 척수에서 첫 광견병 바이러스의 백신을 개발했다. 이것은 감염된 후 항상 죽음에 이르게 한 광견병이 더 이상 사형선고가 아님을 의미 했다. 하지만 백신발견과 많은 진보에도 불구하고 광견병 바이러스에 의한 연간 사망자수는 세계적으로 4만~7만명 사이로 측정 되었다. 탄자니아의 최근 연구결과는 광견병에 의한 사망자의 수가 공식적 기록보다 100배 더 높을지도 모른다는것을 보여주고, 실제 광견병바이러스의 단지 3%만이 중앙 보건당국에 기록된다고 주장한다.

감염환자의 40%가 어린아이이기 때문에광견병도 세계에서 7번째로 중요한 감염질병이다.

그러므로 좀 더 저렴하고 효과적인 백신이 필요하게 되었다.  이 논문에서는 바이러스의 cell cycle과 바이러스-숙주세포 상호작용 단계를 포함한 광견병 바이러스의 세포 생물학적 지식을 서술할 것이다.



Rabies virus는 Rabdoviridae에속한다. 광견병 바이러스는 11개의 genotype을 가진 2개의 그룹으로 나뉜다.

Rabies virus의 캡시드는 나선형 구조이다. 외피는 glycoprotein이 위치하고, 지질막의 안쪽에는 matrix protein이 붙어있다.

negative-stranded RNA 게놈은 nucleoprotein(노랑) 안으로 빽빽히 둘러쌓여있고, 이를 ribonuclioprotein (RNP)라고 한다.


두가지의 다른 바이러스단백질은 RNP와 연관되어있다. 내부코어 또는 캡시드를 만드는 바이러스 polymerase(파랑)과 phosphoprotein(오렌지).


캡시드는 트라이머인 single transmembrane glycoprotein(보라)과 matrix protein(초록)에 의해 숙주 세포의 막으로 들어간다. matrix protein(초록)은 캡시드와 비리온막과 single transmembrane glycoprotein사이의 다리역할을 한다.



life cycle

첫번째 단계인 Endocytosis는 숙주 세포 수용체에 의해 바인딩되어 바이러스와 endosom 막이 융합되고, 세포질로의 바이로스 게놈의 방출도 야기한다. 박쥐 광견병 바이러스를 이용한최근의 연구가 바이러스는 혈액으로 퍼지고 시상하부의 신경혈관에 있는 중추신경계에 침입한다는 것을 보여줌에도 불구하고, 전형적인 야생형 광견병 바이러스는 신경근육에 있는 운동 신경으로 들어간다.

어떤 경우든지, 광견병 바이러스 입자는 감염된 신경의 축상을 역행하여 연속적으로 수송된다. 일단 바이러스 입자가 신경의 세포체에 도달하면, 바이러스 구성요소를 생산하는 transcription, replication, protein synthesis 단계가 시작된다.

 Life cycle의 마지막 단계인 budding은 다른세포로의 새로운 감염을 시작 할 수 있도록 바이러스 구성요소를 조립하고 바이러스 입자를 방출한다. 이 과정의 각 단계는 상당히 통제되어 진행된다. 

rabies virus의 transcription


감염 직후, 게놈을 주행으로 먼저 leader RNA와 6개의 mRNA로 전사된다. leaderRNA는 cap과 polyA tail이 없으나, 5개의 mRNA, N, P, M, G, L 는 cap과 polyA tail이 있다. 우선 leaderRNA를 전사한 후 N, P, M, G, L mRNA를 전사한다. 전사 시에 각각 전사되는 것이 아닌 single site initiation으로 전사된다.


(single site initiation: 앞쪽에 하나가 전사 안되면 뒤의 것도 전사되지 않는것 예) P유전자가 불활성화 되면 P뿐만아닌 M,G,L 단백질의 합성도 저하 됨 

 multi site initiation은 계속 전사 가능)


유전자 mRNA의 전사 개시는 유전자 사이에 존재하는 intergenic region이 관여한다. intergenic region이 termination과 polyadenilation 뿐만 아니라 downstream RNA 합성의 initiation, capping을 조절한다. 실제 intergenic region 에서 polymerase complex가 일시적으로 멈춘 후 그중 일부만이 다음 유전자의 개시에 성공하게 된다. 결국 다음 유전자의 전사는 점차 감소하게 된다. 이러한 감쇠현상으로 mRNA의 생성은 그림과 같이 leader RNA, N , P , M , G, L 순으로 감소한다

 

Replication와 transcription은 네그리 소체에서 이루어진다.

네그리 소체는 ubiquitylated proteins과 heat shock protein70이 (HSP70)로 이루어져 있다. 네그리 소체의 형성은 Toll-like receptor 3 (TLR3)에 의존한다. 이는 광견병 바이러스 복제에 사이트의 공간 배열에 관여한다. 숙주 세포의 세포질 안으로 RNP가 방출된 후에, RNP의 간결한 나선 모양은 활성화되어 이완 단계로 전환되어야 한다. 바이러스성 mRNA의 번역은 바이러스성 게놈이 negative sense  RNA이기 때문에 바로 일어날 수 없다. I게다가, nucleoprotein에 의한 게놈과 안티게놈의 단백질 막으로 둘러쌈은 이 과정을 방해한다.

Nucleoprotein의 promoters 사이의 중합은 RNP를 형성


rabies virus가 뉴런 세포로이동하는 기작. 대부분 알려져 있지 않음 nAchR이 receptor 로여겨지나 nAchR을 block 시켰을 때에도 transport가 이루어진 점을 미루어 보아 nAchR 이외에도 다른 receptor가 transport에 관여하는것으로 보임. 그러나 nAchR을 blcok하면 virus의 증식 정도가 약함. 따라서 nAchR은 virus의 증폭에 영향을 미침

 Rabies virus에 감염되면  Rabies virus의 5′triphosphate ended RNA는 retinoic acid-inducible gene I (RIG-I)에 의해 감지되고, TRAF-family-member-associated NF-카파B activator (TANK)와TANK-binding kinase 1 (TBK1)–I카파B kinase 엡실론 (IKKε)복합체로 신호를 전달하여 IFN regulatory factor 3 (IRF3)의 인산화를 유도.

인산화 된 IRF3는 이량체가 되고, 핵으로 운반되어 transcription factor 2 (ATF2)와 nuclear factor-카파B (NF-κB)와 결합하고 IFNB의 전사를 유도하여 면역반응이 일어난다.


또한, 일부 연구에서는 Toll-like receptor 3 (TLR3)에 의한 신호전달이 IFNβ를 유도함을 보여준다.(다른 TLR의 기능은 여전히 밝혀지지 않았다.)


Rabies virus는 이러한 숙주세포의 면역반응을 억제하는 기작을 가지고 있다. 광견병 바이러스 인단백질(RVP)을 통한 기작인데, RVP는 병원체-연관 분자 패턴과 1형 2형 IFN 신호전달에의한 숙주세포반응의 차단함으로써 인터페론(IFN) 반응을 회피한다.

RVP는  IRF3의 인산화를 방지함으로써 IFNβ 유도를 억제한다.

RVP는 1형(IFNα and IFNβ)과 2형 (IFNγ) 신호전달경로를 억제할 수 있다.

1형과 2형 IFN수용체(IFNR)가 트리거 됨에 따라 signal transducer 와 transcription 1 (STAT1)의 활성화는 Janus kinase (JAK)에 의해 인산화 된다.

 RVP는 인산화된 STAT1과 결합하고, STAT1이 핵으로 이동하는것을 방지해서 뒤이어 오는 항바이러스전사반응을 막는다.

 핵에서는 짧은 버전의 RVP가 STAT1과 STAT2의 IRF9( IFN-stimulated growth factor 3 (ISFG3)복합체의 형태) 의 헤테로다이머 복합체와 STAT1 호모다이머와 결합한다.

이는  IFN-stimulated response element (ISRE)와γ-activated sequence(GAS)와 1형과 2형IFN연관 면역반응의 전사적 활성을 막는다.

 

다른버전의 RVP는 사용 전사적 시작 사이트에 따라 생산된다.(삽도 참조)

인단백질3(p3), P4와 P5는 핵 방출 신호(NES)를 떨어뜨리고 핵에서 축적된다.




apoptosis와 rabies virus

 

많은 향신경성 바이러스들은 신경병원성적 메커니즘으로 apoptosis를사용한다.

광견병바이러스에의한  apoptosis 유도는 논란이 많은 토픽이었다. 하지만 병원성 광견병바이러스주는  apoptosis를 유도하지 않는다.

초기에는 광견병 바이러스 감염이  apoptosis에 중요한 역할을 할 것이라고 여겨졌다. CVS계통의 광견병 바이러스에 감염된 rat 전립선암 세포에서  apoptosis 유도가 발견되었기 때문인데, 그러나 병원성이 아닌 감쇠된 바이러스 주 CVS-B2C는 primary mouse neuron에서의  apoptosis를 유도하지만, 병원성 CVS-N2c는  apoptosis를 유도하지 않았다. 이는 인간 광견병이  apoptosis를 유도하지 않는다는 증거가 될 수 있다.


( apoptosis가 바이러스에의해 유도된다면 감쇠된 바이러스보다 병원성 바이러스에서 더 많은 apoptosis 유도가 일어나야 하기 때문)


또 다른 근거로 다른 연구들에서도 감쇠된 광견병바이러스(예를들어 백신주)가 병원성 광견병 바이러스주에 비해 더 많은 pro-apoptotic 표현형을 나타내는것을 확인 할 수 있었다. 하지만 한가지 예외로 병원성 광견병 바이러스 주 CVS 감염은 감염된 뉴런에 의한 CD95 리간드(FASL 로 알려진)의 조기upregulation 에 의한 T세포의  apoptosis를 유도한다.


또한 광견병 바이러스 감염동안의  apoptosis 유도는 케스페이즈 의존, 케스페이즈 독립 페스웨이에 의해 일어나는데, 광견병 바이러스 감염후의 AT3과 jrkat 세포에서의 anti apoptosis 단백질 B세포 림프종2의 과발현은  apoptosis를 방지한다.


또한, 시토크롬c와 같은 pro apoptotic 단백질의 발현은 광견병 바이러스의 병원성을 줄일수 있다.


병원성 바이러스주가 바이러스복제와 전사, 당단백질의 아미노산 서열의 변화에의해 전적으로 세포사멸을 제한하는지  apoptosis를 방지하기위해 추가로 직접적 메커니즘을 사용하는지의 여부는 알려져 있지 않다.



rabies virus 감염 증상과 치료

 

광견병에 걸린 동물에 물린 사람의 15-50%에서는 약 3-8주 또는 일년까지되는 잠복기를 거쳐 열, 두통, 식욕부진, 피로, 통증과 같은 전구기 증상 (prodrome phase)들이 나타나며, 감각신경흥분상태 (sensory excitation phase)로 들어간다.

. 감각신경흥분상태에서는 과도흥분상태 (hyperactivity), 환각 (hallucination), 발작 (seizures), 이상한 행동 등과 같은 신경증상이 나타나며, 특히 액체를 마실 때, 근육의 경련성 수축 (spasmodic contraction)이 나타난다. 이 상태의 환자는 물을 보기만 하여도 증세가 나타나는 공수증 (hydrophobia)이 발생한다.

. 공수증의 증세는 2-7일간 지속되며, 증세가 심해지면서 급작스러운 심장마비나 호흡기 마비 또는 혼수상태가 나타난다.


미국의 최근 PEP(예방책)는 불활성된 광견병 바이러스 백신과 면역글로불린 으로 이루어져 있다. 이 요법은 효과적이지만 광견병이 흔한 개발도상국에서는 높은 가격과 낮은 이행률때문에 유용하지 않다.

WHO는 개발도상국에서 백신의 가격을 낮추기 위해 대안책을 승인했다. DNA 백신을 포함한 비활성된 백신 사용을 의존하지 않는 치료법 또한 연구되고 있다.


최근 연구로 iNOS의 유도가 광견병바이러스의 병원성을 줄일수 있을지의 여부가 관심이 된다.

광견병을 포함한 다른 향신경성 바이러스에 감염 된 쥐의 뇌에서의 Inducible nitric oxide synthase(iNOS)의 mRNA 수준을 조사했는데, 헤르페스 바이러스1과 보르나병 바이러스와는 대조적으로, iNOS mRNA는 광견병바이러스에 감염된 일부 동물에서만 발견되었다.

또한, 모든 광견병바이러스감염 동물에서의 최소한의 염증의 발견은 iNOS 유도는 광견병 바이러스의 신경병리학적 관찰에서 관련이없다는 증거를 제공한다.

이 가설을 지원하는  Phares 는 iNOS의 효과로 잘 알려진 뇌-혈액 장벽의 투과성의 변화가 광견병바이러스 감염의 저항에 유용하고, 바이러스 제거를 촉진할 수 있음을 보여줍니다. 이는 iNOS 생산 억제가 광견병 감염 쥐의 죽음을 늦춰준다는 ubol의 발견과는 대조적이다.

그러나, 두 연구는 다른 광견병 바이러스주(즉 높은 병원성과 감쇠 바이러스주(Phares 외)와 fixed 바이러스주(ubol 외))를 사용하였고 다른 접종경로를 사용하였다.

대부분의 연구 결과는 iNOS 유도는 뇌-혈액 장벽 투과와 필요에의한 출입에 필수적임을 보여준다.

 

Posted by 찬재

댓글을 달아 주세요

  1. 생명학도

    정말 감사합니다 광견병 발표 자료 찾고있었는데 큰 도움이 됬어요 ^^

    2011.06.07 15:45 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]
    • 도움이 되셨다니 다행이네요
      얼마전의 제 ppt발표 때 쓴겁니닼ㅋㅋㅋ

      2011.06.07 16:18 신고 [ ADDR : EDIT/ DEL ]
  2. 쿠앙

    이 논문의 원본이 있나요??

    2012.05.14 21:31 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]
    • 정확히 기억나진 않습니다만 The cell biology of rabies virus: using stealth to reach the brain 일거예요

      2012.05.14 22:43 신고 [ ADDR : EDIT/ DEL ]
  3. 쿠앙

    감사합니다. ^^ 덕분에 정말 많은 도움이 될 것같네요 ㅎㅎ
    행복한 하루 보내시긜~ ㅎㅎ

    2012.05.15 09:43 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]
  4. 와우

    감사합니다 과제하는데 완전 짱짱

    2015.05.26 08:56 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]
  5. 정말 감사합니다 광견병 발표 자료 찾고있었는데 큰 도움이 됬어요 ^^

    2015.11.04 06:41 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]


면역침강 기술의 장점은 관심있는 항원을 분리하여 더 측정하도록 해주는 것이다. 주어진 세포 또는 조직형 내 특정항원의 존재를 민감하게 측정할 수도 있다 세포 또는 조직을 분해하여 만든 추출물을 침강시킬 항원-항체 복합체를 형성하기 위하여 관심있는 항원에대한 항체를 혼합한다. 그러나 만약 항원 농도가 낮다면(주로 세포와 조직 추출물의 경우에), 항원=항체 복합체가 침전물 로 모이는데는 몇 시간, 심지어는 며칠이 소요될 수도 있으며, 형성된 소량의 면역 침전물을 분리하는것이 어렵다. 이러한 한ㄲ께를 피하는 몇가지 방법이 있다. 그 중 한 방법은 원심분리기에 의해 항원-항체를 부착시키는 것이다. 또  다른 방법은, 1차 항체에대해 특이적인 2차 항체를 첨가하여 항원-항체 복합체를 결합시키는 것이다. 만약 2차 항체가 비드에 부착된다면, 그 면역 복합체는 원심 분리에 의해 모아질 수 있다. 이 과정의 특히 독창적인 변형은 2차 항체와 자기 버드의 결합을 포함한다. 2차 항체가 1차 항체에 결합한 뒤, 튜브의 측면에 자석을 갖다 대면 침강이 모인다.
생합성 방사능 동위원소 표지와 항체 결합에서 쓰일 때, 면역침강은 또한 특정 항원이 실제로 세포나 조직에 의해 합성되는 지 여부를 결정하는데 이용될 수도 있다. 하나 혹은 그 이상의 방사능 표지 아미노산을 함유하는 세포 배양기에서 세포를 성장시킴으로써 관심있는 세포로부터 합성된 단백질을 방사능으로 표지할 수 있다. 일반적으로, 이러한 용도로 사용되는 아미노산은 류신, 시스테인 혹은 메티오닌과 같이 대사에 의한 수식에 가장 저항성이 높은 것들이다. 방사능 배지에서 배양한 후, 세포들을 용해시키고 여기에다 관심있는 항원에 대해 특이적인 1차항체를 가하여 처리한다. 항원-항체 복합체는 면역침강으로 회수하고, 단백질 내로 병합되지 못한 방사능-표지 아미노산과 다른 불순물들이 제거되도록 세척한 다음 분석한다. 그 복합체는, 합성된 단백질의 양을 정량적으로 분석하기 위하여 섬광계수기(scintillation counter)를 사용하여 계수한다.
항원-항체 복합체를 좀 더 분석하기 위해서는 때때로 항원-항체 복합체를 통상 SDS와 열을 처리하는 방법으로 와해시키는데, 따라서 면역침강된 항원 단백질의 존재유무는 그 관심있는 항원의 에상 분자량을 조사함으로써 확인 할 수 있다. 이는 와해된 항원-항체 복합체를 SDS-PAGe로 분리한 다음, 겔 상에서 방사능-표지 항원의 위치를 결정하기 위한 방사선 자동사진법(autoradiography)를 수행함으로서 확인할 수 있다.

kuby 면역학
Posted by 찬재

댓글을 달아 주세요

Transfection

DNA를 culture 중인 cell 내로 유입시켜 외부 DNA가 세포 내에서 발현되도록 하는 것이 transfection의 목적이다. DNA는 negative charge를 띄는 분자이고 cell membrane 또한 negative charge를 띈다. 따라서 DNA를 cell 속으로, 더구나 핵 속으로 까지 유입 시키는 것은 여러 가지 특별한 agent를 사용한다, 높은 tranfection efficiency를 얻는 것이 모든 실험의 관건이다.

DNA를 cell 내로 유입 시키는 방법은 크게 chemical method, physical method, virus mediated method 등 3가지로 분류할 수 있다. Chemical method 에는 calcium-phosphate, DEAE-dextran, Lipofectin등의 cationic liposome 등이 DNA를 packaging하는 agent 로 사용된다. Physical method로는 electroporation, gene gun 등이 이용되며, 그밖에 virus-mediated method로서 adenovirus나 retrovirus의 virus genome에 원하는 DNA를 cloning 삽입하여 세포에 감염시키는 방법도 많이 사용되고 있다. 각각의 방법은 저마다의 장점과 단점이 있으므로 실험목적과 잘 맞는 방법을 선택하여야 할 것이다.

실험방법

* 실험재료
10cm dish에 배양한 NIH3T3 cell
DMEM(10% FCS, antibiotics 함유)
Phosphate Buffered Saline
1x Trypsin-EDTA
Serum free medium(serum과 antibiotics가 첨가되지 않은 DMEM) 또는 opti-MEM
6 well plate
0.4% tryphan blue solution
hemocytometer
cover glass
cell counter
Lipofectamin plusTM(BRL)
DNA
Transfection에 사용할 DNA는 CsCl 법이나 이에 상응하는 방법으로 분리한 ultra pure한 상태이어야 한다. Qiagen의 midi column을 사용하면 간편하게 0.1 mg 이상의 pure DNA를 얻을 수 있다.


Transfection

여기에서는 chemical method의 한 가지인 cationic liposome을 이용한 방법을 설명하고자 한다. BRL사 에서 Lipofectamin plus 라는 상품명으로 판매하는 transfection reagent는 적은 양의 DNA로도 높은 transfection efficiency를 얻을 수 있는 장점이 있으나 매우 고가의 시약이다. 본 설명의 DNA 양 및 시약 사용량은 직경 35 mm well (6 well plate) 에 실험할 경우이므로 다른 scale 의 plate를 사용할 경우에는 해당하는 scale에 맞게 조정해야 한다.

1. PBS, serum 및 antibiotics 가 첨가되지 않은 medium을 30분 전에 37°C water bath에 담가놓는다.

2. Clean bench 내에서 멸균된 eppendorf tube에 DNA를 혼합한다. (6 well 기준, 1 well 당 1 μg 정도)

3. Serum free medium 또는 Opti-MEM 100 μl 와 Plus reagent 4 μl를 혼합하여 이를 DNA와 잘 혼합한다(pipette 사용). 15분간 상온에서 incubation 한다.

4. Serum free medium 또는 Opti MEM 100 μl에 Lipofectamin을 2 μl 가하고 이를 3과 혼합한 다음 15분간 상온에서 incubation 한다.

5. Incubation 하는 동안, 6 well plate를 PBS (1 ml/well) 2번 세척한다.

6. Serum free medium을 well 당 0.8 ml 씩 가한다.

7. 4의 DNA mix를 6의 well 에 넣고 plate를 가볍게 흔들어 골고루 섞이게 한다.

8. CO2 incubator에서 3시간 incubation한 후 serum 및 antibiotic이 포함 되어있는 complete medium으로 갈아주고 다시 CO2 incubator에서 배양한다.


http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_workshop/cell_culture.php

100파이 dish
 pipet
H1N1-NP
turbofect 8ul

e-tube에 opti-mem 1ml 넣음
H1N1-NP 3.5ul 넣음
turbofect 8ul 넣음
incubation 20min
petrydish에 293-EBNA에 e-tube에 넣었던 것들 듬성듬성 넣음
잘 섞은 후 incubation 48h

이번실험은 transfection 으로 DNA를 culture 중인 cell 내로 유입시켜 외부 DNA가 세포 내에서 발현되도록 하는 실험이다.
DNA와 cell membrane 은 (-) charge 를 띄고 있어 DNA를 cell membrane 안의 핵으로 보내는데는  chemical method, physical method, virus mediated method 를 사용한다. chemical method 는 reagent를 사용하여 DNA를 (+) charge로 감싸 cell membrane을 잘 통과시켜주게 하고, physical method 는  electroporation 으로 cell membrane 을 약하게 만들어 DNA가 들어갈 수 있게 하는방법이고, virus mediated method 는 virus에 원하는 DNA를 넣어 숙주를 감염시키는 방식으로 transfection 하게 되는데 우리는 a형 돼지 influenza virus 인 H1N1-NP 를 사용하여 transfection 하였다.
100파이 dish 에 DNA 최적량 8ug~10~ug
reagent dna 1:2 가 최적 이번실험에서는 1:1
Posted by 찬재

댓글을 달아 주세요

24 well plate

EPC cell
u-tube
pipet
virus (IHNV, VHS CJB)
crystal violet
PEG
methyl cellulose overlay

24 well plate 에cell seeding
clean bench 에서 virus infection (IHVN, VHS CJB)
10^1~10^8 까지 희석시킴( u-tube 8개 media 900ul, virus 100ul)
24well에  10^6~10^8 까지 희석시킨것을 넣음
PEG 처리 200ul
incubation 15min
methyl cellulose overlay
7day incubation

media 버림
crystal violet staining
30min incubation
흐르는 물에 washing
pfu 계산

결과
12 x 10^8 x 10ml = 1.2x10^10PFU/ml

discussion

이번실험은 virus를 EPC cell에 infection 시켜 pfu를 계산하는 실험이었다.
실험과정중 PEG 는 수분을 흡수하는 역할로 virus가 cell과의 interaction을 더 좋게 해준다. methyl cellulose overlay
는 다음세대의 virus에 의해 cell의 재감염을 막아 정확한 PFU 계산이 가능하게 해준다. 우리가 사용한것은 methly cellulose overlay(MC) 이지만 MC 이외에도 agar, agarose, carboxymethylcellulose, liquid medium, starch 와 같은 solid, liquid overlay들을 사용하여도 된다.
pfu 계산을 위해서는 plaque 수를 세어야 하므로 crystal violet 과 같은 vital dye 로 live cell 만을 염색시켜 plaque의 수를 센다. 이 때 cell이 제대로 seeding 되어있지 않으면 seeding되지않은 부분이 crystal violet 에 의해 염색되지 않으므로 정확한 plaque 수를 셀 수 없으므로 주의하여 seeding 한다.
우리는 virus의 희석배수를 10^3~10^8 의 virus의 plaque 수를 희석배수 별로 관찰 할 수 있었다. 이는 plaque 의 유효갯수가 10~100 개 이므로 신뢰도 높은 well 의것을 선택하여 pfu를 계산할 수 있게 함이다. 우리조의 경우 IHVN(Infectious hematopoietic necrosis virus. negative-sense single-stranded RNA virus that is a member of the Rhabdoviridae family) 를 10^8 의 희석배수로 희석한 well의 것의 PFU를 계산 하였다.








lid and liquid overlay 종류

agar, agarose , methylcellulose, carboxymethylcellulose
, liquid medium, starch


Agar overlay media.

A sterile 2% solution of agar in distilled water was prepared from purified agar
(Difco Laboratories, Detroit, Mich.) repeatedly washed with saline (0.85% NaCI). The final concentration
of agar was 1% and was prepared by mixing equal volumes of melted agar and double-strength maintenance medium at 45°C. The secondary overlay consisted of 1% agar overlay medium containing 1/10,000 (wt/vol) neutral red.

MC overlay medium.
 
The methylcellulose (MC) overlay medium was prepared as described by Schulze and Schlesinger (24). A final concentration of 0.5% MC (Methocel, 4,000 CP, Fisher Scientific Co., N.J.) in maintenance medium was used as the overlay medium.

CMC overlay medium.

The carboxymethylcellulose (CMC) overlay medium was prepared in the same manner as that for MC. The final concentration of CMC (Nutritional Biochemicals Corp., Cleveland, Ohio) in the overlay medium was also 0.5%. Liquid overlay medium. Maintenance medium, without specific antiserum, was used for the liquid overlay.

Antibody overlay medium.
 
Specific hyperimmune sera for use in antibody overlay media for Cox B-3 (bovine), Western equine encephalomyelitis (mouse), and Newcastle disease (guinea pig) viruses were obtained from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Research Reference Reagents Branch, whereas hyperimmune sera to adenovirus type 3 and VSV, SIN, SFV, and Sendai viruses were prepared in rabbits by standard methods.
The antiserum was applied in maintenance medium for the antibody overlay.



JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, May 1977, p. 535-542

Variables Affecting Viral Plaque Formation in Microculture Plaque Assays Using Homologous Antibody in a Liquid Overlay

A. S. RANDHAWA,* G. J. STANTON, J. A. GREEN, AND S. BARON
Department of Microbiology, The University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas 77550,* and
Laboratory of Viral Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of
Health, Bethesda, Maryland 20014
Received for publication 6 January 1977

Posted by 찬재

댓글을 달아 주세요

plaque는 바이러스감염에 의해 세포가 용해된곳. 관찰위해 세포 염색을 하면 염색이 안된 부분
colony는 미생물 이 증식하여 육안확인 가능한 미생물집락. 색깔이 있는부분

plaque forming units (PFU).
계산시의 오류를 최소화하기 위하여 여러 희석 배수를 사용하며, plaque가 20-100개정도 형성되는 plate로 count하여 titer를 계산한다.

PFU/mL = Plaque수×희석배수×mL로 환산한 접종량

예) 10-6 희석액 0.1mL에서 50개의 plaque가 관찰되었다면, stock 용액내의 바이러스 역가는 50×106×10 = 5×108 PFU/mL



plaque counting을 더 용이하게 하기 위해 vital dye로 세포단층을 염색한다.
염색약의 종류로는

methylene blue 동물세포의 핵 염색
crystal violet 자주색의 염기성 색소. 주로 그람염색
neutral red 붉은 색의 염기성 색소 니슬 소체 염색, 다른염색약과 대비염색에 주로 사용
Eosin 보편적 헤마톡실린의 대비염색에 사용.  세포질, 세포막을 빨강이나 분홍으로 염색 
bismarck brown solution bismark solution(1g) + 증류수(100cc). 노란색으로 살아있는세포의 세포질 염색. 끓이면 색소가 파괴된다.
Carmine 글리코겐을 붉은색으로 염색

여기서 확실하게 plaque assay에 쓰이는건 methylene blue, crystal violet, neutral red 
다른건 vital dye 이긴 한데.... 실제 쓰이는지는 잘...ㅋㅋㅋ 
Posted by 찬재

댓글을 달아 주세요

  1. 화학과 대학생

    글 잘봤습니다. 질문하나만 할게요. 콜로니랑 플라크가 각각 용원성 용균성 바이러스랑 관련이있다고 배웠는데, 이거좀 알려주세요..

    2012.07.31 10:10 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]
    • 용원성 바이러스와 용균성 바이러스는 숙주 세포를 죽이며 사는가 아니면 같이 기생하며 살아가는 가의 차이입니다. 콜로니는 염색을하면 염색이되고 플라크는 염색을하면 염색이 안되는 부분이 플라크입니다. 요게 플라크 부분의 세포가 죽어서 염색이 안되는거예요

      2012.07.31 21:19 신고 [ ADDR : EDIT/ DEL ]