실험동물에 관한 법률


제4조(다른 법률과의 관계) 실험동물의 사용 또는 관리에 관하여 이 법에서 규정한 것을 제외하고는 「동물보호법」으로 정하는 바에 따른다.


제17조조(교육) ① 다음 각 호의 자는 실험동물의 사용·관리 등에 관하여 교육을 받아야 한다.

1. 제8조제1항에 따른 동물실험시설 설치자

2. 제8조제2항에 따른 관리자

3. 제12조에 따른 실험동물공급자

4. 그 밖에 동물실험을 수행하는 자

② 식품의약품안전청장은 제1항에 따른 교육을 수행하여야 하며, 교육 위탁기관, 교육내용, 소요경비의 징수 등에 관하여 필요한 사항은 보건복지부령으로 정한다.<개정 2010.1.18>


 제21조(기록) 동물실험을 수행하는 자는 보건복지부령으로 정하는 바에 따라 실험동물의 종류, 사용량, 수행된 연구의 절차, 연구에 참여한 자에 대하여 기록하여야 한다.<개정 2010.1.18>
 
제18조(재해 방지) ① 동물실험시설의 운영자 또는 관리자는 재해를 유발할 수 있는 물질 또는 병원체 등을 사용하는 동물실험을 실시하는 경우 사람과 동물에 위해를 주지 아니하도록 필요한 조치를 취하여야 한다.

② 동물실험시설 및 실험동물생산시설로 인한 재해가 국민 건강과 공익에 유해하다고 판단되는 경우 운영자 또는 관리자는 즉시 폐쇄, 소독 등 필요한 조치를 취한 후 그 결과를 식품의약품안전청장에게 보고하여야 한다. 이 경우 「가축전염병예방법」 제19조를 준용한다.

③ 동물실험 및 실험동물로 인한 재해가 국민 건강과 공익에 유해하다고 판단되는 경우 운영자 또는 관리자는 살처분 등 필요한 조치를 취한 후 그 결과를 식품의약품안전청장에게 보고하여야 한다. 이 경우 「가축전염병예방법」 제20조를 준용한다.

 

 제19조(생물학적 위해물질의 사용보고) ① 동물실험시설의 운영자는 보건복지부령으로 정하는 생물학적 위해물질을 동물실험에 사용하고자 하는 경우 미리 식품의약품안전청장에게 보고하여야 한다.<개정 2010.1.18>

② 제1항의 보고에 관한 사항은 보건복지부령으로 정한다.<개정 2010.1.18>

 

 제20조(사체 등 폐기물) ① 동물실험시설의 운영자 및 관리자 또는 실험동물공급자는 해당 시설에서 나온 실험동물의 사체가 외부에 유출되어 재이용되거나 재해가 발생되지 아니하도록 처리하여야 한다.

② 동물실험시설과 실험동물생산시설에서 배출된 실험동물의 사체 등의 폐기물은 「폐기물관리법」에 따라 처리한다.




동물보호법

제3조(동물보호의 기본원칙) 누구든지 동물을 사육·관리 또는 보호함에 있어서는 생명의 존엄성과 가치를 인식하고 그 동물이 본래의 습성과 신체의 원형을 유지하면서 정상적으로 살 수 있도록 노력하여야 한다.

제6조(적정한 사육·관리) ①소유자등은 동물에게 적합한 사료의 급여와 급수·운동·휴식 및 수면이 보장되도록 노력하여야 한다.

②소유자등은 동물이 질병에 걸리거나 부상당한 경우에는 신속한 치료 그 밖에 필요한 조치를 하도록 노력하여야 한다.

③소유자등은 동물을 관리하거나 동물을 다른 동물우리로 옮긴 경우에는 그 동물이 새로운 환경에 적응하는데 필요한 조치를 하도록 노력하여야 한다.

④ 소유자등은 등록대상동물을 기르는 곳에서 벗어나게 하는 경우에는 농림수산식품부령이 정하는 바에 따라 소유자등의 성명·주소 등이 표시된 인식표를 부착시켜야 하며, 인식표가 없이 돌아다니는 등록대상동물은 유기된 것으로 본다.<개정 2008.2.29 >

⑤ 소유자등은 등록대상동물을 동반하고 외출하는 때에는 농림수산식품부령이 정하는 바에 따라 목줄 등 안전조치를 하여야 하며 배설물이 생긴 때에는 즉시 이를 수거하여야 한다.<개정 2008.2.29 >

⑥시·도지사는 등록대상동물의 유기 또는 공중위생상의 위해 방지를 위하여 필요하다고 인정하는 때에는 시·도의 조례가 정하는 바에 따라 소유자등으로 하여금 동물에 대하여 예방접종을 하게 하거나 특정 지역 또는 장소에서의 사육 또는 출입을 제한하게 하는 등 필요한 조치를 할 수 있다.

⑦ 그 밖에 동물의 적절한 사육·관리방법 등에 관하여 필요한 사항은 농림수산식품부령으로 정한다.<개정 2008.2.29 >

제13조(동물실험의 원칙) ①동물실험은 인류의 복지의 증진과 동물 생명의 존엄성을 고려하여 실시하여야 한다.

②동물실험을 실시하고자 하는 때에는 이를 대체할 수 있는 방법을 우선적으로 고려하여야 한다.

③동물실험은 실험에 사용하는 동물(이하 “실험동물”이라 한다)의 윤리적 취급과 과학적 사용에 관한 지식과 경험을 보유한 자가 시행하여야 하며 필요한 최소한의 동물을 사용하여야 한다.

④실험동물의 고통이 수반되는 실험은 감각능력이 낮은 동물을 사용하고 진통·진정·마취제의 사용 등 수의학적 방법에 따라 고통을 덜어주기 위한 적절한 조치를 취하여야 한다.

⑤동물실험을 행한 자는 그 실험이 종료된 후 지체 없이 당해 동물을 검사하여야 한다. 이 경우 당해 동물이 회복될 수 없거나 지속적으로 고통을 받으며 살아야 할 것으로 인정되는 경우에는 가능한 한 빨리 고통을 주지 아니하는 방법으로 처리하여야 한다.

⑥ 누구든지 다음 각 호의 동물실험을 하여서는 아니 된다. 다만, 해당 동물종(種)의 건강, 질병관리연구 등 농림수산식품부령이 정하는 불가피한 사유로 농림수산식품부령이 정하는 바에 따라 승인을 받은 경우에는 그러하지 아니하다.<개정 2008.2.29 >

1. 유기동물을 대상으로 하는 실험

2. 맹도견·안내견 등 인간을 위하여 사역한 동물을 대상으로 하는 실험

 

Posted by 찬재

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  1. 재야~~~

    감사히...ㅋㅋ역시니한테잇을줄알앗다;ㅋㅋ

    2010.09.01 17:17 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]
    • 찬재

      ㅋㅋㅋ 누나도 신경생물학인가 들어? ㅋㅋㅋ 범수형도 이거봤음ㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋ

      2010.09.01 21:51 [ ADDR : EDIT/ DEL ]


원래 ppt로 만든게 있는데 ppt가 사라졌음.. 밑의 글은 ppt 발표용 대사...
그룹발표였는데.... 나혼자 찾고 나혼자 ppt만들고 나혼자 발표하고 나혼자 점수 잘받았습니다.
나혼자하던거라 내용이 춈... 미흡한점 없지않아 있네요 ㅋㅋㅋ

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음치의 사전적 정의는 음에대한 감각이 둔하고, 목소리의 가락이나 높낮이 등을 분별하지 못하는 상태, 그리고 음악에 대하여 아는 것이 없거나 노래가 서투른 사람을 말합니다.

다시 말해 음의 높이에 대한 인식이 부족하여 노래를 부를 때 음정이 바르지 않는 것 그리고 그런 사람을 칭합니다.

음치에 대한 개념 정의는 학자마다 내용 및 수준을 달리하고 있는데, 이노우에 다케오는 한 개의 음도 악기나 다른 음을 듣고, 맞춰 부르지 못하거나 한음, 또는 몇 개의 음은 바르게 불러도 그 밖의 음은 바르게 부르지 못하고, 음정을 물리게 부르는 어린이를

음치아 라 정의 하였고, 문영일은 음에 대하여 여러 면에서 서투를 때 음치 라는 말을 사용하며 원래의 의미는 음악에 대한 지능이 없다는 뜻으로 특히 음정과 박자가 맞지 않는 방법으로 노래 할 때 음치 라 정의합니다. 음악 심리학자 레베츠는 음치를 이미 가지고

있던 음악적 능력을 잃어 더 이상 음이나 음의 상호간의 관계 및 음악적 형상을 인지하지 못하거나 재현하지 못하는 사람이라고 정의했습니다. 이들 여러 학자의 의견을 종합해 보면 음치라는 개념은 어떤 특수한 경우만을 가르키는 것이 아니라 일반적이고 보편적, 통상적인 의미를 지니고 있다고 할 수 있습니다.

 

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음치의 종류를 크게 나누면 감각적 음치와 운동적 음치로 나눌 수 있습니다. 감각적 음치는 청각능력에 관계되는 것으로 음의 고저 ·강약 ·장단 ·화음 ·리듬 등을 정확하게 인식하지 못하는 것을 의미하고 운동적 음치는 재생하는 능력, 즉 인식한 음을 소리 또는 악기로

재현하지 못하는 것을 의미합니다.

 

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감각적 음치와 운동적 음치로 구분하는 방법 이외에 선천적 음치와 후천적 음치로도 구분할 수 있는데, 선천적 음치는 태어날 때부터 음감각이 다른사람에 비해 둔하고 음의 높낮이를 제대로 파악하지 못하는 경우가 많습니다. 어렸을 적 부터 현상이 나타나므로 노래에 대한 거부감으로 후천적인 음치로 전이되는 것이 일반적입니다.

후천적 음치는 음감각이나 음의 분별능력은 정장적이나 노래에 대한 관심부족이나 음악을 접하지 않은 환경으로 인한 음치를 말합니다.

 

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음치의 원인중 생리적 이유로는 몸의 어느 한 부분에 이상이 있기 때문에 음치가 된 경우로 후두, 혀, 호흡기 등의 발성기관에 이상이 있을 때 음치가 됩니다. 또한 청각 능력이 음치에 영향을 줍니다. 그러나 생리적 음치는 매우 극소수 이며 이것은 전문적인 의사의 치료가 필요하고, 학교의 음악 교육을 통해서는 교정이 어렵습니다. 생리적 이유이외에 심리적 이유가 있는데 심리적 이유는 여러가지 현상이 복합적인 원인이 되어 생긴 음치이기에 단정적으로 정의를 내릴 수는 없습니다만 생리적 음치를 제외한 다양한 원인 때문에 생긴 음치라 할 수 있습니다.

 

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심리적 음치의 원인에 대해 몇 가지 알아보자면 적절한 시기에 알맞은 음악적 교육을 받지 못하여 음 경험의 부족으로 음치가 된 경우와 그릇된 음정 지도에 의해 음치가 된 경우, 노래에 대한 두려움으로 인해 음치가 되는 경우가 그 원인 이라고 할 수 있습니다.

 

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박치는 음정은 정확하나 박자를 놓치거나 노래에 맞는 박자를 치지 못하는 것을 의미합니다.

 

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박치의 원인으로는 운동신경이 둔해 자신이 의도한 박자보다 느리거나 빠르게 반응하는 생리적 원인과 정확한 악보상의 박자를 알지 못하고 감으로 노래를 배워 생긴 그릇된 교육에 의한 박치가 있습니다. 박치가 심한경우 노래에 맞추어 박수조차도 제대로 치지 못하는 경우가 많습니다.

 

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박치는 운동신경과 90% 상관관계에 있기 때문에, 계속적으로 몸을 이용하여 박자를 맞춰나가 교정합니다.

신체의 일부를 활용하여 박수를 친다거나 손을 상하로 움직인다거나 발뒤꿈치로 바닥을 쿡쿡 찍는 방법이 있습니다.

 

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길맹은 길눈이 어두운 사람들을 칭하는 말 그리고 방향감각을 잘 모르는 이 를 뜻합니다. 길치는 표준어가 아니며 길맹이 국립국어원에서 등재시킨 표준어 입니다.

 

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길맹의 원인은 세간의 속설에서는 길맹인자들은 일반인들에 비해 지능이 떨어지거나 주변사물에 대한 관찰력이 부족하여 길을 잘 찾지 못한다고 하는데, 영국 런던의 유니버스티 연구팀에 의해 규명된 과학적인 증거로는 길맹의 원인은 뇌의 해마상 융기부분과 격자세포를 교류하도록 돕는 '운항세포'들이 상호 긴밀하게 협력하지 못하기 때문이라고 합니다. 여기서 뇌의 해마상 융기 부분은 지점이나 육상 목표에 관한 기억을 보관하고, 격자 세포들은 공간과 거리에 관한 감각을 사람에게 제공하는 역할을 합니다.

 

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보통 여자가 남자보다 길맹이 많은데 이는 뇌의 발달과정에서의 차이 그리고 심리적인 원인 때문인데 남자는 수학이나 지도읽기, 공간을 인지하는 감각이 발달하는 반면에 여자는 정서적인 생각, 언어 멀티테스킹 능력이 발달하기 때문이고 여성의 경우 남성에 비해 어려움에 처할 경우 누군가의 도움을 받으려는 성향이 강하고 도움을 받기도 쉬워 누군가에 의존하려는 성향이 강하고 모험심이 결여되어 길 찾기를 포기하는 경우가 많습니다.

 

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길치를 치료하기 위해서는 운항세포를 훈련하고 네비없이 지도를 보며 길을 찾는 것을 연습하거나 3D 시뮬레이션을 이용한 치료법이 있습니다.

Posted by 찬재

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the secret of life on earth 식물의 생태계

 

지구상의 모든 생명체는 태양에너지를 흡수하고 그것을 양분으로 전환시키는 능력을 지닌 식물들에게 의존한다.
모든 먹이사슬의 기본은 식물이고 식물을 먹는 채식동물로부터 먹이사슬이 시작된다.
아프리카 누는 풀을먹고살고 사자같은 포식자들의 먹이가된다. 지구상의 모든 영양분은 오직 식물에 의해 만들어진다. 식물이 없으면 지구는 40억년전 지구의 모습이 그러하였듯이 황량한 죽음의 땅이 된다. 40억년전 지구표면은 유독가스로 뒤덮혀있었다. 그러나 그런 환경에서도 자신을 복제할 수 있는 특이한 탄소화합물이 형성되었고 그 화합물에서 최초의 원시세포가 출현했다. 이 원시세포는 태양으로부터 에너지를 흡수, 양분으 만들수 있었다. 그리고 일부는 물과 화합물질을 합성하여 엽록소를 만들고 이 엽록소들이 다시 산소방울을 만듬으로서 마침내 생물체가 살아갈 대기가 생성된것이다. 20억년전부터 10억년동안 조금씩 산소 오존층이 형성되었고 마침내 지구상엔 다양한 종류의 생물과 새로운 식물이 선사시대에 나왔고, 산소가 풍부한곳에선 여과섭이 동물들이 출현하였다.
식물의 줄기속에 관이 형성되어 곧고 튼튼하게 자랄 수 있게 되었고 다른 식물과의 경쟁을 통해 크기도 점점 커지고 이런 역동적인 과정을 통해 최초의 숲이 탄생한것이다.
최초로 상륙한 식물은 유영성 성세포를 갖고있어 습기가 잇는지역에서만 번식가능했다. 그러나 시간이 지나고 식물은 새로은 생식법을 개발했다. 침엽수의 수세포는 바람을 타고 암꽃으로 이동하여 수분하여 씨를 만둔다. 새로운 생식법 덕분에 이들은 매마른 땅에 진출이 가능했다. 해안을 벗어나 언덕을 차지하고 산 정상까지 점령하여 오늘날 전세계 숲의 삼분의 일은 침엽수이다. 그리고 암수가 하나의 장치속에 결합되어 있는 꽃을 이용한 생식이 생겨났다. 꽃의 수분은 곤충들에게 양분을 제공하고 이에대한 대가로 곤충은 꽃들을 옮겨다니며 수분가능하게 되고 배가 수정되는것이다. 대부분의 꽃은 곤충을 끌어들이는 '넥타(꿀)' 를 사용하게된다. 특정한 곤충을 선호하는 식물도 있는데 야생 아룸은 악취로 작은 모기를 유혹해 암꽃이 있는 아랫부분으로 내려가 밤새도록 갇혀있게되고 다음날이면 수꽃이 꽃가루를 배출해 모기들이 꽃가루를 몸에 뭍히고 빠져나가 다른꽃을 찾아가도록 하여 수분을 가능하게 해주기도한다. 특정한 새에 맞춰 크기나 모양이 진화한 꽃도 있다.
포식자와 먹이의 관계가 달라지면서 꽃의 생태계도 복잡하게 변한다. 식물과 동물의 상호관계에 있어 식물이 늘 수동적인 위치에 있는 것은 아니다. 어떤 경우엔 식물이 사냥꾼의 위치에 있기도한다. 거친 토양에서 자라는 어떤식물은 질소를 분비하여 유인하고, 또다른 식물의 잎은 더 지능적인 덫을 이용하여 곤충을 사냥한다. 파리지옥 때가되면 순식간에 덫이 닫힌다
풍부한 생태계는 종종 거친토양에서 시작한다. 미네랄이 끊임없이 재생되어 식물이 생존가능하고 곤충과 균류에의해 부식작물은 식물과 동물의 새 개체들이 언제든 흡수할 수있도록 토양을 변화시킨다. 개화식물과 동물의 관계는 또다른 모습이다. 수분이 끝나면 꽃은 즙이 풍부하고 색깔이 화려하고 먹기좋은 열매로 바뀐다 예를들어 야생 무화과는 열매를 좋아하는 플라잉 폭스를 유혹한다. 플라잉 폭스가 삼킨 열매의 육질을 소화시키는 씨가 몸을 통해 배설 되 땅위에 퍼지고 떨어진 자리에서 발아한다. 이것은 씨를 퍼뜨리는 아주 효과적인 방법이다. 이런방법으로 거대한 숲이 만들어진다. 씨앗이 한 그루의 유실수가 되기위해선 공간을 차지하기 위해 치열한 경쟁을 한다. 과실과 열매는 인류의 생존가능케한 식량이기도하다. 문명발달에 더 중요한건 또다른 특별한 개화식물로 그식물은 인간의 주식인 가축의 먹이가 되어줄 풀이다. 대부분의 식물은 끝에서부터 자라지만 풀은 밑동부터 자란다. 그래서 가축이 먹어도 다시 자라나 더많은 먹이를 제공한다. 풀역시 꽃을 피우는 식물이.다 우리가 잘 모르는 사실이지만 풀은 곤충도 필요없이 풀의 수분은 바람에 의해 이루어진다. 자리를 잡은 씨앗은 이미 양분을 함유하고 잇어 바로성장한다. 풀을갈아서 가루를 만들면 몇달간 저장가능한 식량이 만들어지기도 한다.

Posted by 찬재

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  1. 감사합니다 ㅠ 뒷부분도 올려주시면 안될까요?ㅜ

    2012.03.01 16:08 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]


MIC 는 세균에 대한 항생제의 최소 저해 농도를 의미합니다.

즉, 다시말하면 세균에게 최소한 어느 정도 양의 항생제를 주어야 생장이 억제되느냐, 그때의 항생제의 농도를 구하는 것이죠.

항생제에는 수많은 종류가 있고, 세균에는 더 많은 종류가 있습니다.

그런데 항생제라고 해서 모든 세균에 적용되는 것은 아니고,

각 항생제의 작용부위와 기작에 따라서 저해할 수 있는 세균이 있고,

그렇지 못한 세균이 있습니다.

예를 들면, 유명한 페니실린(penicillin)과 같은 경우는 세포벽 합성을 억제함으로 항균작용을 하는데, 세포벽이 peptidoglycan으로 두껍게 되어있는 그람 양성균의 경우에는 페니실린에 의해서 잘 듣지 않습니다. 다른것을 사용해야죠.

그리고 세균의 일반적인 특성 중의 하나가, 항생제에 대하여 쉽게 내성을 가진다는 점입니다. 실험을 하게 되시면 알겠지만, 불과 반나절 사이에 내성을 가진 돌연변이체가 생기는 것을 보실 수 있습니다. MIC 실험은 이러한 면에서 적절한 양의 항생제를 투여하기 위한 기초실험으로도 생각할 수 있습니다.

 

MIC 실험과정은 다음과 같습니다.

먼저 여러개의 균주를 overnight 배양해서 튼실하게 준비합니다.

그리고 항생제를 준비하고, 액체배지를 여러개 플라스크에 준비하여 항생제를 여러 농도로 각각 넣지요.

그리고 각 단위시간(1시간 또는 30분) 간격으로 OD를 측정하고 plate에 깔아서 CFU를 잽니다.

그래프를 그려서 각 농도별로 비교해보면 최소 저해농도를 알 수 있습니다.

2. Determination of the activity

2.1 Inhibitory activity

일반적으로 MIC를 측정함

MIC(minimal inhibitory concentration): 미생물의 생육을 저해하는데 필요한 최저 농도

방법

1.Mueller Hinton broth를 사용하여 액체 배지를 만듬.

2.10개의 튜브를 준비하여 한 개는 4ml, 나머지는 2ml씩 배지를 채움.

3.따로 2.와 같이 10개 만듬.

4.균을 희석하기 위한 배지를 만듬.

5.고압증기 멸균 후 2의 튜브들에 항생제 첨가.

6.튜브에서 2ml씩을 옮겨 2배씩 희석.

7.대장균의 농도를 희석하여 저농도의 튜브에서부터 대장균을 이식.

8.incubation

9.균이 자라지 않는 최소 최소 농도를 측정.

[출처] MIC(Minimum Inhibitory Concentration)|작성자 하드발레

1. MIC 측정 방법

- Test tube를 series로 준비하고 시험균주가 접종된 동일량의 배지를 분주, Inoculum은 103 - 106 cells/ml tube, microwell을 보통 사용하기도 함

- 시험하고자하는 항생제의 농도를 조정(일반적으로 1/2 단계적 농도로 함, 즉 stepwise 2-fold dilution으로, 예: 128, 64, 32, 16 mg/ml), positive control(항생제 무첨가) 필요

- 시험균주의 생육적온에서 배양, 생육에 충분한 시간 동안, 10 -15 generation time(보통 o/n) 정도

- 육안으로 생육 여부를 관찰, 탁도(turbidity)는 적어도 107 cell/ml tube를 나타냄, “last" clear tube의 항생제 농도가 MIC

이와같이 MIC는 stepwise 2-fold dilution과 visual determination 방법을 사용함으로 아주 정확한 방법은 아님, 그러나 항생제 연구와 임상에 있어서 아주 유용한 parameter로 사용되고 있음, 시험균주에 따라(예: species), 실험조건에 영향을 받음

2. 고체 배지상에서의 측정방법

액체 배지상에서와 기본적으로 동일, 109 cells/ml 정도의 시험균주(피검균)가 함유된 MH(Mueller-Hinton, Difco) 배지를 기본으로 반합성배지를 주로 사용. 배양 후에 균 생육 여부를 관찰. 한 번(1 plate)에 여러 시료에 대한 MIC 측정이 가능

- 농도 : 100 ㎍/ml로부터 2배 희석(100, 50,2 5, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56, 0.78, 0.39, 0.20, 0.10, 0.05, 0.025 등). 100 ㎍/ml 이상인 경우에는 200, 400, 800, 1,600 ㎍/ml으로

- Inoculum(접종균액) : 약 106 cells/ml, 장기간 보존한 균주를 사용할 때는 적어도 1회이상 계대 배양하고 계대 배양 직후의 균을 사용. 37℃에서 18-20시간 정도 배양하면 S. aureus 209P와 E. coli NIHJ 균주의 경우 108-109 cells/ml에 달함

 

얼빵하신 조교님이 직접하신 실험이라 실험결과가 제대로 안나옴...


이번실험은 mic측정으로 mic는 세균에 대한 항생제의 최소 저해 농도 로서 세균의 생장을 막는데 필요한 최소한의 농도를 찾는데에 있다.
mic 측정방법중 고체배지를 이용한 방법과 액체배지를 이용한 방법을 사용하였는데 먼저 고체배지를 이용한 실험부터 시행하였다.
고체배지를 이용한 방법으로는 페트리접시에 배지와 박테리아를 도말하고 3개의 칸을 나누어 각각 다른 항생제를 투여한다. 이 때 알코올 램프 근처에서 실험을 진행하여 무균의 상태에서 진행하여야 다른균에 의한 잘못된 결과 가 생기지 않는다. 또 로더를 이용한 도말을 시행할 시 너무 세게 문지르면 배지가 찢어질 수 있으므로 조심한다.
항생제를 넣고 하룻밤 culture 한다. 배양중인 페트리접시는 뒤집어서 보관하는데 이는 중력에 의하여 박테리아들이 골고루 분포시키기 위함이다.
박테리아가 항생제에 내성을 가지고 있다면 항생제를 뭍힌 종이 근처에도 박테리아가 자라나고,
내성을 가지고 있지 않으면 항생제를 뭍힌 종이 근처에는 둥그렇게 박테리아가 자라지않는 공간이 생긴다. 해당 항생제에 감수성이 좋은
박테리아 일수록 박테리아가 자라지 않는 반경원이 커진다. 그리고 그 넓이를 계산하는 것이다. 그러나 우리 실험을 비롯한 모든 조의 실험에서 실험시 무언가 빠뜨린게 있어
제대로된 결과가 나오지 않았다.
그리고 액체배지를 이용한 실험은 각각 5개의 코니컬 튜브에 다른농도의 항생제를 넣고 박테리아가 자라나는지 확인하는것인데.이 역시 모든 농도의 튜브에서 박테리아가 생장하여
항생제에 내성을 가지고 있는것으로 생각된다.

Posted by 찬재

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  1. 굿

    좋은ㄴ자료 감사합니다!!!

    2011.05.23 14:54 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]
  2. 안녕하세요! MIC에 관한 자료조사를 찾다가 이 포스트를 발견했는데,
    다른 곳은 너무 설명이 복잡하고, 이 포스트가 풀어서 설명하기
    딱 좋은 정도인 것같아서, 작성중인 과제물에 일부분(서론에 MIC가 무엇인지 설명하는 부분과 간단한 실험과정 정도) 인용할 수 있을까요?

    2016.07.18 01:41 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]

어류
어류는 원구류와 일부의 어류를 제외하고는 모두 몸 표면이 비늘로 덮여있다. 수서생활에 적응한 유선형의 몸구조에 옆줄, 아가미, 부레 및 지느러미를 갖는데 가슴지느러미와 배지느러미는 사지동물의 팔다리에 해당하는 상동구조로 취급된다.

1 무악어류

흔히 원구류라 하는데 입은 원형이고 턱이 없다. 여과형섭식을 한다. 척삭을 일생동안 갖고 있으며 진정한 치아는 없고 사지와 몸통을 이어주는 전지연결대나 후지연결대를 갖지않는다. 예 먹장어, 칠성장어

2.판피어류
머리는 부분적으로 골화가 되었으며 턱뼈를 갖는다. 일생동안 척삭을 가지며 내골격의 일부가 뼈로 되어있다. 이들은 처음으로 쌍으로 된 부속지를 갖는다. 예 동갑어류 절갑어류

3.연골어류
온몸에 연골로 된 골격만을 가지며 턱이 잘 발달하고 있으나 두개골은 신경두개의 형태를 한다. 부레는 없으며 방패비늘을 갖는다. 수컷의 배지느러미는 안쪽이 변형되어 교미기가 되어있기도한다. 연골어류는 5~7개의 아가미틈새가 잘 발달되어 있으며 아가미뚜껑이 없는 상어, 별상어, 홍어 등과 같은 판새어류와 연골어류이면서 위턱이 두개골과 결합하여 고정되어 있으며, 성체는 비늘을 갖지 않고 4쌍의 아가미가 1개의 근육질로 된 아가미 뚜껑에 의하여 덮여있는 은상어와 같은 심해에 서식하는 어류인 전두류가 있다. 전두류는 척삭을 일생동안 유지하며 물구멍과 같은 구조는 없다.

4.경골어류
판피어류를 조상으로 진화하였으며 내골격이 대부분 뼈로 되어 있고 대부분 부레가 있다. 아가미는 가동성이 있는 새개골로 덮여있고 막성뼈와 치환뼈로 이루어진 전지연결대가 있으며 몸표면에는 둥근비늘과 빗살비늘같은 비늘이 잘 발달되어있다. 경골어류는 지느러미의 모양과 부레의 기능에 따라 지느러미, 치아 및 두개골의 뼈ㅓ구조 등이 초기 양서류와 많이 닮은 총기류, 보통은 아가미호흡을 하지만 경우에 따라 부레로 폐호흡을 하는 폐어류와 둥근비늘이나 빗살비늘을 갖는 잉어, 붕어, 농어, 메기 등의 조기류 등으로 나뉘어진다. 척추동물해부학 49-51

어류의 골격
어류의 골격은 두골, 척주, 늑골, 흉대, 요대 등의 각 뼈와 기골로 구성되어 있다. 이들은 다시 크게 몸통 골격과 사지골격으로 나뉘어 진다
1몸통골격
몸통골격은 두개골, 척주, 늑골로 구성된다
2사지골격과 지느러미
어류는 사지동물의 앞다리와 뒷다리에 상응하는 운동기관으로 지느러미를 갖고 있으며 이들 지느러미를 몸통에 연결하는 전지연결대와 후지연결대를 갖고 있다. 일반생물학실험 235 물고기뼈그림 복사

 

오징어
연체동물문으로 몸은 좌우대칭이며 어느 부분이고 환절적인 구조는 전혀 볼 수 없다. 몸은 머리, 발, 내장낭 및 외투막의 4부분으로 되어있다. 두부는 몸의 앞부위에 있고 발은 특별하게 발달된 근육으로서 먹이의 포획과 이동에 사용된다. 표피에는 선세포가 많고 대개는 석회질을 분비하여 패각을 형성한다. 두부에는 입, 눈, 촉각 등이 있다. 내장낭은 뚜렷한 구분이 이루어져 있지 않으나 비교적 단순한 소화관과 부속선을 가지고 있다. 내장낭의 일부가 분화되어 몸을 둘러싸는 막이 되는데 이것이 외투막이다. 외투강 내에는 아가미, 신관의 배설공, 항문 등이 개구한다. 소화계는 전장, 중장, 후장으로 되고, 소화기관은 입, 식도 , 위 , 소장, 직장, 항문으로 통한다 항문이 열려 있는 좌우에 1쌍의 날개 모양인 아가미가 있다. 대부분의 연체동물은 한번 이상의 유생시기를 거친다. 오징어는 두족강으로 두부가 비교적 잘 발달되어 있고 발은 입 주변에 위차한 10개의 발과 누두로 변화하였으며 그 중 특히 긴 2개는 생식기로 변하였다. 일생 231-232


쥐는 가장 우세한 포유류목의 하나인 설치목에 속하며, 크고 끌같이 생긴 문치가 특징이고, 그 빠른 번식률로 전 세계적으로 넓게 분포되어 있다.
 
 외부형태
 (1) 머리 : 안면부와 두 개부로 구성되어 있다.
   ① 입술 : 윗입술은 보통 중앙에서 인중이라 부르는 홈에 의해 외비공까지 파열되어 있다.
   ② 눈 : 흰 쥐의 눈에는 색소가 없어 붉은색을 띤다.
   ③ 귀 : 이개(耳介)라고 부르는 부드러운 주름을 갖는다.
   ④ 강모 : 안면에 긴 감각모가 있으며, 이 털의 모낭 속에 감각신경말단이 coil을 이루고 있다.
   ⑤ 턱 : 한쌍의 문치가 있고, 치아 표면에는 에나멜질이 없기 때문에  항상 날카롭게 자르는 끝면을 가지고 있다.  
 (2) 몸통 : 앞쪽의 흉부와 뒤쪽의 복부로 나눈다.
 (3) 사지
 (4) 꼬리 : 몸의 균형을 잡는데 사용하며, 피부에서 기원한 중복된 비늘이보이는데 그 사이에 짧은 털이 나있다. 
 
3. 내부형태
 (1) 골격계 (skeletal system)
 (2) 근육계 (muscular system)
 (3) 소화계 (digestive system)
1. 구강 : 뺨, 입술, 치아, 혀 등
2. 식도 (esophagus) : 인두와 위를 연결한다.
3. 위 (stomach) : 소화관의 팽대부로 네 부분으로 나누어진다.
4. 소장 (small intestinum) : 위에서 연속되는 관으로 십이지장, 공장, 회장의 세부분으로 구성된다.
5. 대장 (large intestinum) : 맹장, 결장, 직장으로 구성된다.
6. 간 (liver) : 중간엽, 우엽, 좌외엽, 미상엽 등 4엽으로 구성된다.
7. 췌장 (pancreas)
8. 비장 (spleen)
 (4) 호흡계 (respiatory system)
1. 비강 (nasal cvity)
2. 인두 (pharynx)
3. 후두 (larynx)
4. 기관 (trachea)

 (5) 순환계 (circulartory system)
1. 심장 (Heart)
2. 혈관계 : 동맥, 모세혈관, 정맥
3. 림프계
 (6) 비뇨생식계 (urogenital system)
1. 신장 (Kidney) : 장간막에 매달려 있는 다른 복장기와는 달리 복막에  의해 덮혀있다.
2. 수뇨관 (Ureter) :신장에서 방광으로 뻗은 관상의 복막후 구조
3. 방광 (Urinary bladder) : 배모양의 막성 주머니로 뇨의 저장소
4. 요도 (Yrethra)
 (7) 감각기관 (sense organ)
 (8) 신경계 (nervous system)


쥐그림3개 복사


뇌에는 자극의 전달과 조절을 총괄하는 중추가 들어있으며 신경계의 중심이 된다. 뇌는 대뇌 중뇌 소뇌 간뇌 연수 척수로구성되어 있고 척추동물의 뇌는 어느종류나 같은 구조를 하고 있으나 동물에 따라 그 모양이나 크기가 각기 다르다. 포유류의 뇌는 여러가지 종류의 동물들보다도 더욱 뚜렷하게 발달되어있다. 특히 대뇌피질이 매우발달해 있으며 소뇌도 대단히 크다. 대개 포유류에서도 고등한 종류일수록 홈이나 주름의 수가 많고 복잡하다.동물해부학 268 뇌사진


(싸이월드에 올려놨던걸 그대로 옮겼더니 크기가 너무 작네요. 망할 싸이월드같으니 멋대로 리사이징이나 하고말이야)

 

첫사진은 rat 의 뇌 다른것은 모두 오징어


토의

이번실험은 어류와 오징어, 쥐 의 기관및 장기 를 해부하는 실험이었으나 먼저 실험해본 분반에서 전어를 해부해본 결과 해부실험에는 적합하지 않다고 여겨져 우리는 오징어와 쥐를 해부했다.
오징어는 연체동물중 두족류로 머리에 다리가 달려있고 머리와 몸통이 연결되는부분에 누두 라는 물을 뿜는 기관이 있다. 그리고 흔히 우리가 머리로 부르는 삼각형인 부분은 지느러미 이다.
오징어의 다리인 촉완 에는 톱니모양의 빨판이 있어 이를 사용하여 먹이를 잡는데 해부할때 이것에 상처를 입지않도록 주의한다. 그리고 오징어의 입은 머리부분에 촉수들에 감추어져있다. 오징어의 머리부분이 붉은빛이 도는것은 색소가 있기대문인데 이는 오징어에게 상처가 없을때만 띄는 것이다. 이로서 외부관찰을 끝내고 내부관찰을 하기위하여 오징어의 몸통부분을 수직으로 절개하는데 라텍스장갑을 착용하여야 미끌거리는 오징어를 잡는데 용이하고, 절개시 해부용가위의 날카로운부분이 위쪽에 위치하게 하고, 뭉퉁한 부분을 아래쪽으로 두어 내부장기가 손상되는것을 막아야 한다.
오징어는 몸통과 머리를 고정시켜주는 후크 구조 를 가지고 있어 절개시켜 몸과 머리가 분리되더라도 다시 고정시킬 수 있다.
실험으로 사용할 동물의 해부에는 알콜로 소독을 해주어야 하지만 우리는 관찰을 위해 해부하는것이므로 알콜을 이용한 소독은 하지않아도 무관하다. 외피를 절개시킨 오징어의 몸통의 양 끝부분엔 산소공급을 해주는 아가미가 위치해 있다. 그리고 몸통의 윗부분에는 다른장기에비해 새하얗고 커 구분하기 쉬웠던 기관인 간 이 있고 간의 아래에는 간과 크기가 비슷하나 간보다 회색빛이 도는 기관이 있는데 이는 맹장이다. 그리고 그 주위에는 생식기능을 하는 노란빛을 띄는 생식소가 위치한다.
이 기관들을 절개해 내면 길죽하고 흰빛을 띄는 위가 있고 근처에 노란알갱이가 여러개 뭉쳐진모양인 소화선이 있다. 위의 근처에는 작고 동그란 신장이 하나 있고 심장과 아가미심장이라는 독특한 기관이 있다. 오징어의 내부를 관찰할때는 먹물주머니가 터지지 않도록 주의해야한다.
오징어의 촉수들을 벌려보면 입을 볼 수 있는데 이를 절개해보면 기다란 식도가 연결되어있는 것을 관찰 할 수있다.
 쥐
이번에 사용한 쥐는 지난학기때 사용한 rat 보다 크기가 작은 mouse로 이번에는 쥐의 뇌를 관찰했다. 먼저 쥐를 경추탈골법으로 죽인 후 머리를 자르는데 mouse는 그 크기가 작기때문에 작두를 이용하지 않고 가위를 사용하여 머리를 잘라냈다. 잘라낸 머리의 양 귀를 약간 잘라내고 이를 뒤집어 머리를 잡는데 사용하고 두개골을 제거하는데 mouse 는 rat 과 달리 두개골이 굉장히 연하여 핀셋으로 제거한다. mouse의 두개골은 수컷일수록 그리고 크기가 클수록 두껍다. 두개골을 핀셋으로 제거한 후 핀셋을 사용하여 쥐의 눈과 코가 있는 안면쪽에 핀셋을 넣어 뇌를 들어올리면 시신경이 뇌와 연결되어있는것이 보인다. 시신경을 제거하고 뇌를 꺼내보면 대뇌와 뇌의 아랫부분에 둥근모양으로 붙어있는 시상하부를 관찰 할 수 있다. 쥐의 뇌 해부는 지난학기에도 해보아 자신이 있었는데 mouse는 rat 과 달리 그 크기가 굉장히 작아 해부하기가 rat보다 어려웠고 절개해낸 뇌의 크기 또한 굉장히 작아 자세한 관찰이 힘들었다.

쥐 해부에대해 더 자세하게 알고 싶다면
http://chanjae.tistory.com/24

Posted by 찬재

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  1. cloran

    아... 맛있겠다... 오징어 좋아함. 구워먹어도 괜찮고, 쪄먹어도 되고, 말려먹어도 맛있음. 회를 쳐도 되고.

    오징어 소녀 2기 방송 시작했어요. 보셨음?

    2011.10.01 21:32 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]
    • 세피로스횽.... 아이디 바꾸는거 재미들리셨넼ㅋㅋㅋ
      자일렌에 이어서 클로란임미깤ㅋㅋㅋ 그리고 실험레포트글 에서 이러면 아무도 안보는뎈ㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋ

      2011.10.02 13:57 신고 [ ADDR : EDIT/ DEL ]
  2. 오징어

    오징어 해부도를 찾다가 여기까지 오게되었는데요

    저 오징어 해부도의 출처를 알고 싶습니다

    저렇게 자세하게 나와있는 해부도를 찾고 싶은데 여기서 처음봤네요 ㅠㅠ

    생물학도 이신것 같아 또 질문합니다만 오징어에 대해서 나와있는 책은 어떤 책이 있을까요

    2011.10.13 07:53 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]
    • 저 해부도는 조교님이 주신거라 어디 나온지는 잘 모르겠지만 해양생물학책이나 동물실험, 해부 책 찾아보시면 있을거예요.

      2011.10.13 16:05 신고 [ ADDR : EDIT/ DEL ]
    • 오징어

      해양생물학책은 한번 찾아봤었는데

      속구조에 대해서는 없더라구요 ㅠㅠ

      해부책도 척추동물에 대한건 엄청 많던데

      더 찾아봐야겠습니다 ^^ 감사합니다

      2011.10.14 00:32 [ ADDR : EDIT/ DEL ]
    • 지금 본문 다시 보니 본문에다 레퍼런스 적었었네요 ㅋ
      일반생물학실험 책에서 찾았나봅니다 ㅋ

      2011.10.14 10:58 신고 [ ADDR : EDIT/ DEL ]
    • 오징어

      도서관에 있는 일반생물학 실험책 다 뒤졌더니

      연체동물 해부에서는 거의 대합이 많이 나오고

      오징어 해부는 딱 2권에서 다루고 있었어요

      ㅠㅠ 그런데 다 오징어 뇌쪽은 안 다루더라구요

      그래도 완전 막막하다가 찬재님 덕분에

      이거라도 찾을수 있었어요 ^^ 감사합니다

      2011.10.14 23:14 [ ADDR : EDIT/ DEL ]
  3. 비밀댓글입니다

    2013.07.27 22:17 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]
  4. 비밀댓글입니다

    2014.01.19 20:46 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]


광합성

 광합성은 빛에너지를 생물체가 이용할 수 있는 유기화합물 형태인 화학에너지로 전환시켜주는 과정이다. 즉, 태양에너지가 특정 분자들의 결함에 의해 포도당의 생성에 이용되는 과정으로 반응물은 CO2와 H2O이며, 생성물은 포도당(C6H12O6), H2O, O2이다. 즉 태양에너지가 특정분자들의 결합에 의해 포도당의 생성에 이용되는 과정으로 반응물은 co2와 h2o이며 생성물은 포도당(c6h12o6),h20,o2 이다.
전체반응식은 6CO₂+12H₂O →C6 H12 O6 + 6O₂+ 6H2O(ΔG= +686 kcal/mole)로 흡열반응이다.
광합성의 반응은 두가지 경로로 나눌 수 있다.

-명반응
틸라코이드 막에서 일어나고 빛에너지에 의해 추진된다. 이 경로에서 atp와 환원된 전자운반자(nadph + h+) 가 만들어진다.

-켈빈-벤슨반응(암반응)
명반응후에 일어나는 반응으로 스트로마에서 일어나고 빛을 사용하지 않는다. 여기에서는 명반응에의해 만들어진 atp, nadph + h+, 그리고 co2를 사용하여 당을 생성한다.

광합성에 영향을 주는 요인
광합성은 빛의 세기에 의해 영향을 받는다. 강한 빛을 받을수록 광합성량이 증가하는데, 빛의 세기가 어느 한계에 이르면 더 이상 광합성량이 증가하지 않고, 이때의 빛의 세기를 광포화점이라 한다. 광합성은 효소가 많이 참여하는 반응이기 때문에 온도의 영향도 받는다. 보통 35℃에서 가장 잘 일어난다. 또 광합성은 이산화탄소 농도에 의해서도 영향을 받는다. 빛이 강할수록 이산화탄소 농도에 영향을 많이 받으며, 이 경우에도 빛에 의한 광합성량과 마찬가지로 어느 한계 이상에서는 광합성량이 더 이상 증가하지 않는다.

사자책 142p , 동아백과

광합성 색소
스팩트럼의 가시영역의 파장을 흡수하는 분자를 색소 라고 한다. 포든 파장의 가시광선을 가진 하얀 빛이 색소에 투시되면 빛의 어떤파장은 흡수된다. 산란되거나 통과되는 나머지 파장으로 인해 우리눈에 색소들이 색을 띄게 보이게 되는것이다. 예를들어 엽록소 처럼 색소가 파란색과 빨간색을 흡수한다면 우리가 보는것은 남겨진 빛인 초록색이다.
광합성에 사용되는 빛에너지는 단일형태의 색소에서만 흡수되지 않는다. 그보다는 서로 다른 흡수 스팩트럼을 가진 몇몇 다른 색소들이 실질적으로 광합성을 위해 이용되는 에너지를 흡수한다. 모든종류의 (식물, 원생생물, 세균)의 광합성생물에서 이색소들은 엽록소, 카로티노이드, 그리고 피코빌린을 함유하고 있다.
식물의 엽록소는 주로 엽록소a 와 b 의 두종류가 존재한다. 이 두분자는 분자구조에서만 약간 다를 뿐이다. 둘다 헤모글로빈의 헴기와 유사한 복잡한 고리구조를 가진다. 엽록소의 각고리의 중심에 마그네슘원자 한개가 존재하며 고리의 외부에는 엽록소를 틸라코이드막의 소수성 부위에 부착시키는 긴 탄화수소꼬리가 있다.

사자책 146쪽 그림8.7

엽록소a 는 가시광선의 양끝인 파랑과 빨강 파장을 흡수하는것을 볼 수 있다. 따라서 엽록소만이 광합성 반응에서 활성을 가진다면 가시스팩트럼의 대부분은 사용되지 않을것이다. 그러나 광합성을 하는 모든 생물체는 빨강과 파랑사이의 중간에너지의 광자를 흡수하는 보조색소를 갖고 있다.
보조색소중 하나는 파랑과 청록 파장에서 광자를 흡수하며, 진한노랑색을 나타내는 베타카로틴과 카로티노이ㅡ 이다. 홍조류와 남조류에서 발견되는 피코빌린은 다양한 황록, 노랑, 오렌지색의 파장을 흡수한다. 이런 보조색소들은 엽록소와 함께 가시 스팩트럼의 대부분을 흡수할 수 있는 에너지 흡수시스템을 구성한다.

① 엽록소

    엽록소 a(청록색) - 광합성을 하는 모든 식물

    엽록소 b(황록색) - 녹조류, 육상식물

     엽록소 c - 갈조류

     엽록소 d - 홍조류
 
 
  ② 카로티노이드계 색소

     : 황색계통의 색소로 카로틴, 크산토필ㅋㅌ00//

       빛에너지를 흡수하여 엽록소로 넘겨주는 보조색소.
 


 

크로마토그래피

○ 크로마토그래피는 화합물들의 혼합 상태를 구성 성분들로 분리하는 방법이다. 각각의 구성 성분들로 분리함으로써, 다양한 시료 성분들을 정성적으로 그리고 정량적으로 쉽게 측정할 수 있다.


종이
종이 크로마토그래피는 원리상으로 분배 크로마토그래피의 일종이다. 분배 크로마토그래피에 의한 분리는 두 가지 종류의 서로 혼합되지 않는 용매 사이에서 혼합물들이 두 용매에 대한 분배 계수가 다른 원리를 사용한다.
    이 때, 한 용매(주로 물)는 정지상의 구실을 하고 다른 용매는 이동상의 구실을 하여 물질을 분리하는데, 이 때 정지상의 지지체(supportin medium)에 따라 종이 크로마토그래피, 얇은 막(thin layer) 크로마토그래피, 분배 대롱 크로마토그래피 등으로 분류하며, 용도에 따라 여러 종류의 물질 분리에 이용된다.
    종이 크로마토그래피에 있어서 거름종이에 흡착된 용매(물)는 정지상의 구실을 하고, 물과 섞이지 않는 유기 용매는 이동상의 구실을 한다. 일반적으로 거름종이는 약 20%의 흡착수가 포함되어 있으므로 거름종이에 시료를 녹이는 것에 해당되며, 거름종이는 정지상을 지지해 주는 지지체(supporting medium) 역할을 한다.
    시료 용액을 거름종이에 소량 찍어 점적하고 말린 다음, 밀폐된 용기 속의 물로 포화된 유기 용매에 그 한쪽 끝을 담가 두면, 용매는 모세관 현상에 의하여 종이의 위쪽으로 스며 올라가거나 또는 중력에 의해 아래쪽으로 이동하게 된다. 이 때, 시료의 성분도 용매와 함께 이동하지만, 각 성분은 물과 유기 용매에 대한 용해도의 차이 때문에 이동 속도가 각각 다르게 된다.
    즉, 유기 용매에 잘 녹는 성분은 덜 녹는 성분보다 먼 곳까지 이동하게 되므로, 거름종이 위에서 성분들이 분리된다. 종이 위에 분리된 각 성분의 위치는 이들이 무색일 경우에는 적당한 발색 시약을 뿌려서 쉽게 확인할 수 있다. 또, 각 성분의 이동 거리는 Rf값으로 나타낸다.
    종이 크로마토그래피는 그 조작이 비교적 간단하고, 미량의 시료(5㎍ 이하)로써도 분리 능력이 좋아 여러 가지 미량 물질을 정량적으로 확인하는 데에 매우 편리하게 이용된다.
http://user.chollian.net/~hl5nol/paper.htm

 

전개중 사진


 

토의

 

이번실험은 식물에서의 색소분리 실험이었다. 색소분리에는 종이크로마토그래피 를 사용하여 분리해내었다. 식물의 잎에서 색소를 분리해 내기 위해서는 아세톤을 이용하여 식물을 녹이고 잘게 짖이겨 색소성분을 아세톤속으로 녹인다. 아세톤은 휘발성이라 아세톤이 공기중으로 날아가 아세톤의 양이 줄어들 수 도있지만 이는 색소의 농도가 더욱 진해지는것으로 오히려 더욱 진한 실험결과를 볼 수 있다. 원심분리 후 여과지를 준비하는데 여과지를 맨손으로 만지면 손의 유분성분때문에 실험결과에 영향을 줄 수 있으므로 색소를 전개시킬 부근은 만지지 않도록 한다. 여과지에 2cm 정도 높이에 연필로 표시해 놓고 가운데 부분에 tip 으로 색소를 살짝 찍으면 모세관현상에 의하여 색소가 tip 으로 올라온다. 이 tip 으로 여과지의 표시해 둔 부분을 살짝씩 찍는데 이때 색소가 가능한 퍼지지 않도록 주의한다. 색소가 퍼지게 찍히게 된다면 퍼지지 않은쪽 보다 면적이 넓어져 전개할 시 좁은것보다 결과를 알기가 어려워지게된다. 우리 실험에서는 일반 여과지를 사용하여 전개액이 올라오는 속도가 너무 빨라 전개액에 색소가 딸려오는 일이 발생하였는데 전개액에 닿는 부분의 여과지의 양 끝 모서리를 잘라 전개하였다면 전개액이 올라오는 속도가 느려져 분해율이 더 좋았을 것이다. 그리고 우리실험에서는 전개역시 표시해둔 부분에서 2cm 가량 전개액이 올라오고 전개를 멈추고 말려 색소가 덜 올라오게 되었는데 이 역시 전개를 더 오래시켰다면 더욱 명확하게 색소들이 분리되었을 것이다. 그리고 언급이 없어 전개시킨후의 여과지를 그냥 말렸는데 전개율인 Rf 를 구할때는 전개액이 올라온 위치를 표시해야 한다고 나와있었다. 다행히 우리는 2cm 밖에 전개를 시키지 않아 전개액이 올라간부분에 색소가 올라가지못하고 전개액이 올라온부분에서 모두 쏠려있어 전개액이 올라온 부분을 알 수 있어 Rf 를 구할수 있었다. 그리고 Rf를 종이크로마토피의 결과를 책상속에 4일간 방치 후 Rf를 구하려고 꺼내보니 색소가 지워졌는지 노랑색과 초록색의 구분이 힘들었다.

Posted by 찬재
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우성 열성
유전학적으로 생물 내에 한 쌍 존재하는 염색체상에서 동일한 위치에 자리잡고있는 대립유전자중 상대 대립유전자보다 그 효과가 더 잘 드러나는 한쪽유전자의 특성을 우성이라 하고, 반대로 눌려서 드러나지 않는 쪽의 유전자를 열성이라 한다

유전
부모가 지닌 유전적 형질의 절반씩을 물려받아 그 자손은 부모의 형질의 절반씩을 가지는 것
유전형질 [遺傳形質, genetic character]이란 유전자에 의하여 나타나는 모든 성질로 겉으로 식별할 수 있는 형태나 색채만이 아니라, 생물의 행동·습성·지능까지도 포함한다.
하나의 유전자가 하나의 형질을 나타내기보다는 하나의 유전자가 여러 가지 형질을 나타나는데 관여하고, 여러 유전자들이 관여하여 하나의 형질이 나타나게 된다.
유전형질에 대한 연구는 여러 생물에서 행해져 왔는데, 그 중에 대표적인 실험생물인 초파리의 경우 눈의 형태와 색, 몸의 색, 날개의 형태 등에 대한 연구가 이루어졌고, 사람의 경우 야맹증, 혈우병, 색맹, 혈액형, 미맹, 머리색, 피부색, 대머리 등에 대한 연구가 진행되어 왔다.
유전형질에 대한 연구는 생물체의 교배 등을 통해 하게 되는데, 사람의 경우 자유로운 교배가 불가능하므로 직접적인 방법보다는 가계도를 조사하거나, 쌍생아를 비교하여 유전형질을 연구한다.
 

이것들은 1개의 주유전자(主遺傳子)에 의하여 1개의 형질이 지배되고 있는데, 그 중에는

 

1개의 유전자가 몇 종의 형질발현에 관계하는 경우와, 몇 가지 유전자가 공동으로 1개의

 

형질발현에 관여하는 경우가 있다. 사람의 경우는 야맹증 ·혈우병 ·적록색맹(赤綠色盲) ·

 

단지증(短指症) ·혈액형 ·겸형 빈혈증(鎌形貧血症) ·미맹(味盲) ·페닐케톤뇨증(尿症) ·

 

티로신뇨증 ·무(無)카탈라아제혈증(血症) ·알비노[白色症] ·선천성 농아 ·선천성 정신박약 ·

 

운동실조 ·모발색 ·피부색 ·젊은 대머리 등 다수가 분석되어 있다.

 
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염색체 이상이란?

정상적인 부부들은 생식세포(정자 혹은 난자)를 생성하고 이들이 수정되어 태아로 성장하게 됩니다. 그러나 이 생식세포를 생성하는 감수분열과정에서 이상 세포분열로 인하여 비정상적인 생식세포가 생성되어 이들이 수정이 되면 임산부는 염색체 이상을 동반한 태아를 가지게 됩니다. 또 정상적인 생식세포가 수정되어 임신이 되었더라도 그 성장과정에서 이상이 생기면 2개 이상의 다른 염색체 이상을 수반하는 태아가 생성됩니다.

염색체 이상에 의한 태아의 기형은 염색체 수의 이상과 염색체 구조의 이상에 기인합니다. 수의 이상으로는 염색체 21번의 하나 더 많은 다운증후군, 염색체 13번이 하나 더 많은 파타우증후군, 성 염색체 X가 하나인 터너증후군,성 염색체 X가 하나 더 많은 클라인펠터증후군 등이 알려져 있습니다.

염색체 구조의 이상으로는 염색체 5번 단암의 일부가 떨어진 Cri du Chat증후군,염색체 4번일부가 떨어져 나간 Wolf hilschorn증후군 등이 있으며 이밖에 역위, 전좌, 결실, 중복 등에 의해 염색체 구조 이상이 일어나고 태아 기형이 유발될 수 있습니다. 이상 염색체에 의한 기형의 경우 저지능, 미숙아, 기능장애 등의 다양한 이상을 동반합니다.

--> http://www.eunhospital.co.kr/genetic.htm

유전병이란?

간단히 설명하면 유전병이란 유전자 이상에 의해 생기는 질환이다. 보다 정확히 정의하면, 체세포 내에 존재하는 유전자 이상이 표현형으로 나타나며, 같은 유전자 이상이 생식세포(정자, 난자)에도 존재하기 때문에 그 표현형이 자손에게도 전달되는 질환을 통칭하는 것이다. 이러한 유전자 이상이 일어나는데는 몇 가지 원인들이 존재한다. 우선 DNA가 복제될 때, 자연적으로 생기는 오류가 있으며, 둘째로는 여러 가지 화학물질 및 환경적 요인들에 의해서 일어날 수 있는 가능성이 있다. 위와 같은 원인들로 인해 체세포에서만 이상이 생길 경우에는 자식에게 그 질환이 유전되지 않지만, 부모의 생식세포에서 이상이 생기거나 배발생 단계에서 이상이 생길 경우에는 자손에게 유전되는 것이다.

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Class III β-tubulin (primer)

Class III β-tubulin, otherwise known as βIII-tubulin or β-tubulin III, is a microtubule element of the tubulin family found almost exclusively in neurons.

It is possible to use monoclonal antibodies and immunohistochemistry to identify neurons in samples of brain tissue, separating neurons from glial cells, which do not express Class III β-tubulin.
 위키피디아

복제에는 프라이머 라고 불리는 dna 나 rna 로 된 시발체사슬이 복제에 요구된다 dna 복제에서 프라이머는 짧은 단일사슬 rna 이다. 이 rna 사슬은 dna 주형 사슬에 대해 상보적인데 프라마아제 라고 불리는 효소에 의해 한 번에 한 뉴클레오티드씩 합성된다. 그 후 dna 중합효소는 그부분의 dna 복제가 다 끝날 때 까지 프라이머의 3'말단에 뉴클레오티드를 계속하여 첨가한다. 그 다음에 rna 프라이머는 분해되고 dna 가 그곳에 첨가되며, 그 결과 생성된 dna 절편은 다른 효소의 행동에 의해 연결된다. dna 복제가 완료 되면 각각의 딸분자는 오직 dna 로만 이루어져 있게 된다.


중합효소연쇄반응(pcr) 기술은 본질적으로 시험관 안에서 짧은 구역의 dna 를 여러번 복사함으로써 이 과정을 자동화한다
pcr은 다음 일련의 단계가 여러 번 반복되는 주기적인 과정이다
이중사슬 dna는 온열(90~96도)에 의하여 단일사슬로 분리(변성)된다
짧고 인공적으로 합성된 프라이머가 네 종류의 데옥시리보뉴클레오시드3인산(dATP, dGTP,dCTP,dTTP) 및 DNA중합효소와 함께 혼합물에 첨가된다. 염기간의 결합은 G와 C는 세군데에서 수소결합이 일어나고 A와 T는 두군데에서 결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주는것이 좋다.
DNA중합효소가 상보적인 새로운 사슬의 생산을 촉매한다.
한 주기는 수분이 걸려 DNA 의 양을 두배로 만들고 새로운 DNA를 이중사슬 상태로 남긴다. 이론적으로는 주기를 여러번 반복하면 DNA 서열의 사본수가 기하급수적으로 증하될 수 있다.

PCR 기술을 사용하기 위해서는 표적DNA 각 사슬의 3'말단에 있는 염기서열이 밝혀져서 보통 15~30개 염기의 길이이며, 상보적인 프라이머를 실험실에서 만들 수 있어야한다.
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 실험에 이용할 PCR 시험관에 다음과 같이 실험에 사용할 재료들을 혼합하고 pipette으로 잘 섞는다.

 

Template DNA(100 ng/μl) 1 μl

Upstream primer(12.5 pmole/μl)1 μl

Downstream primer(12.5 pmole/μl) 1 μl

dNTP(dA, dC, dG, dT 2.5 mM-each) 2 μl

10x PCR 완충용액 5 μl

증류수 39 μl

Taq DNA polymerase(1 unit/μl) 1 μl (총 부피 50 μl)

[출처] PCR의 기본 원리 와 그 응용성|작성자 조다니엘

 


전기영동
DNA는 인산기 때문에 중성의 PH에서 음전하를 띠고 있다. 이러한 DNA 절편의 혼합물을 다공성 겔의 WELL에 올려놓고 겔을 따라 음극과 양극을 갖는 전장을 걸어준다. 역전하가 끌기 때문에 DNA는 전장의 양극의 방향으로 이동한다. 다공성의 겔은 체와 같이 작용하기 때문에 보다 작은 절편은 보다 큰 것에 비하여 더 빠르게 움직인다. 정해진 시간 후에 그리고 아직DNA 절편이 겔안에 있을때 전력을 끈다. 그런후에 형광을 내는 염료로 분리된 절편을 염색함으로써 자외선을 비췃을대 보이게 할 수있다. 그대 이들은 막대나 반점으로 보이며 조사하거나 개별적으로 추출할 수 있다
전기영동은 다음의 두가지 형태의 정보를 제공한다.
절편의 크기, 특이한 DNA 서열의 존재
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각 문단끝의 숫자는 페이지 책은 우리가쓰는 사자책


이번에실험한 RT-PCR은 지난번 실험에서 추출해놓은 RNA 로 5가지 종류의 primer 와 역전사효소를 이용해서 rna로 cdna를 만들어 역전사시키고 이것을 PCR 즉 복제연쇄반응을시켜 소량의 cDNA 를 대량으로 증폭시킨 후 전기영동을하는것이다. pcr 은 아주 소량의 유전물질 만 있어도 연구하고 싶은 유전자는 무엇이든 대량 생산이 가능하게 해주는 기술이라 할 수있다.  PCR 을 한 후 전기영동으로 -charge를 가진 dna를 +극쪽으로 끌어당겨 dna 의 size 별로 분리해내어  우리가 원하는 size 의 DNA를 추출 할 수 있다. 전기영동에 쓰인 gell 은 1% agarose gell 을 사용하였다. gell의 %를 조절함으로 DNA가 loading되는 속도를 결정할 수 있다.
annealing 은 사용할 물질의 G C, A T 의 포함된 비율의 정도를 보고 조정하여야 한다.
 전기영동을 할때에는 시각적으로 dna들을 보기위해 EtBr을 첨가해 주는데 Ethidium bromide(EtBr)은 DNA 염기 사이로 끼어드는 평면구조를 가진
그룹을 지니고 있어서 DAN 사이로 무척 잘 들어갈 수있다. 이 그룹이 DNA 염기에 결합하면 유리형의
ethidium bromide보다 형광이 증가되어  uv하에서 발광하게 되고, DNA band를 시각적으로 확인하게 해준다.Ethidium bromide는 한가닥과 쌍가닥 DNA및 RNA 검색에 모두 사용할 수
있으나 염료의 친화성이 외가닥에서보다 쌍가닥에서 더 강하다. Ethidium bromide는 강력한 발암물질이고 독성을 지니므로 이 염색액을 다룰 때에는 반드시 비닐장갑을 사용해야한다. 사용 후에는 이 용액은 정화한 후 버려야 한다.
또한 TBE를 첨가 해 주는데 TBE는 Tris Borate EDTA를 줄인 말로서 전기영동에서의 버퍼역할을 한다.
TBE는 짧은 크기의 DNA(<1 kb) 를 전기영동할 때  사용한다. TBE는 같은역할을 하는TAE 보다 좀더 오래 사용 가능한데 이는 buffering capacity가 더 좋기 떄문이다.
조교님이 적어주신 size marker 에 의하면 1000bp 와 500bp 에서 진하게 분리되는데 시간관계상 pcr을 여러번 돌리지 않아 ( 25 cycle )프라이머 GAPDH 를 사용한 실험결과 이외의 것은 거의가 제대로 된 결과가 나오지 않았다. 내가 사용한 프라이머는 베타-튜블린 3 로 실험결과가 제대로 나온 것 같지 않았다.

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초기에 많은 연구자들은 게놈에서 전사된 1차 산물인 RNA의 모든 종류를 모아 유전자의 종류나 유전자수를 파악해 왔다. 1차 산물인 RNA는 단일나선으로 불안정하며 또한 수명이 짧기 때문에 연구자가 시험관내에서 취급하기가 쉽지 않다. 그러나 RNA는 인위적으로 이중나선인 DNA로 전환시킬 수 있다. 이렇게 만들어진 것을 cDNA(copy 또는 complementary DNA)라고 부른다. 따라서 cDNA의 개수로부터 게놈의 유전자 개수를 알 수 있는 것이다. 물론 하나의 cDNA 자체가 바로 하나의 유전자를 의미하지는 않는다.

유전자를 찾는 더 확실한 방법은 cDNA를 얻어 게놈지도 상에서 해당하는 부분을 역추적하는 작업이다. cDNA란 mRNA로부터 거꾸로 얻어낸 DNA 가닥으로 유전자에서 실제 엑손부분에 해당하기 때문에 어느 부분이 유전자인지 확실히 알 수 있다.

 

rna에서 cdna 합성이유

 

cDNA(complementary DNA)는 그 의미에서도 알 수 있듯이 일시적인 실험목적으로 만드는 것입니다. 이러한 cDNA를 제작하는 이유는 첫째, exon에 대한 정보를 얻고자 할 때, 둘째, 진핵생물의 유전자 산물을 얻고자할 때 제작하게 되는데, 원핵생물에는 mRNA splicing이 없기 때문이죠.

 

 

DNA

RNA

5탄당

데옥시리보오스

(2번탄소에 수소가 붙어있다; 리보오스에 비하여 산소원자 하나가 적다;

DNA가 RNA보다 안정성이 높다)

리보오스

(2번탄소에 히드록시기가 붙어있다)

염기

A T G C

A U G C

위치

핵(그 외에 미토콘드리아와 엽록체에)

주로 세포질

형태

이중나선으로 분자가 길다.

단 바이러스의 DNA는 외가닥이다

외가닥으로 존재한다. 때로 rRNA나 tRNA는 3차 구조나 2차 구조를 이루기도 한다. DNA는 단 한 가지 형태뿐이지만 RNA에는 기능이 서로 다른 몇 가지 종류의 분자가 있다. (mRNA, rRNA, tRNA)

성질

DNA는 자연적인 분해나 효소에 의한 분해에 잘 견디며, 손실되더라도 반대 사슬이 상보적 정보를 가지고 있기 때문에 회복 가능하다.

RNA는 DNA에 비하여 -OH기를 하나 더 가지고 있기 때문에 화학적 반응성이 더 크고 일단 변형되면 회복 또한 불가능하다.

 

5-② RNA 분리 과정 중에 주의해야 할 것은 어떤 것이 있는가?

-RNA는 구조가 불안정하여서 RNAase에 의해 쉽게 분해가 된다.

-RNAse는 체내에 손, 눈물, 침 등에 많이 포함되어 있으므로 실험 중에 접촉하지 않도록 주의를 한다.

-시약에 DEPC(RNase inhibitor)를 처리한다.

-용기나 tip은 재사용하지 않는다.

 

5-③ DEPC-treated water를 쓰는 이유는 무엇인가?

DEPC-treated water는 RNA inhibotor 이다. 그래서 이것은 RNase의 작용을 방해하고 없애 주어서 순수한 RNA를 얻을 수 있다. 대부분의 RNase의 active site에는 Histidine이 있고, DEPC는 효과적으로 RNase를 비활성화 시켜준다.

[출처] 동물세포로부터 RNA분리, CRNA의 합성, PCR에

 

 

rna 분리

electrophoresis나 density gradient centrifugation 혹은 ion exchange chromatography등의 방법으로 순수 분리할 수 있다.

토의

이번실험은 rt-pcr 중 rna를 분리해 내는 것으로 trizol을 이용한 실험이다. 이 실험은 지난 실험인 cell harvest , cell counting 에 이어지는 실험이라고 할수 있다.
central dogma 에 따르면 dna - rna - protein 순으로 만들어 지나 이번실험은 역전사효소를 사용하여 rna 에서 dna 를 즉 cDNA 를 만든다.
여기서 굳이 cDNA 를 만도는 이유로는 단백질을 만들어내는 RNA는 실제로 단백질을 구성하는 아미노산을 합성할수 있는부분인 엑손과 아미노산을 합성하지않는 인트론으로 구성되어 있다. DNA 사용하게되면 불필요한 인트론으로 인해 정확하게 단백질로 코딩되는 코돈을 알기 힘든데 RNA 에서 cDNA를 만들면 엑손만을 구할수있기때문에 cDNA를 만들어 실험하는것이다.
RNA 분리시 제일 처음 Tri-reagent 를 처리하는데 Tri-reagent (trizol) 은 RNA 를 분리하는 시약이다.
 Trizol reagent에는 monophasic phenol이 guanidinium thiocyanate와 함께 들어있다. 여기에서 세포를 깬 후 chloroform 또는 BCP라는 시약을 첨가하면 비로소 층이 갈리게 되는데, RNA는 상층액에 남아있게 되고 이 층을 건져 침전시키면 되는 것이다. . Trizol 1마이크로리터당 chloroform 200마이크로리터를 넣어준다. 여기서 넣어주는 choloroform 은 당류와 단백질등 원심분리후 제거되지 않은 찌꺼기를 제거해 주는 역할을 한다. cholorofom 을 첨가한 후 14000rpm, 4도씨 에서 15분간 centrifuge 한후 sup 을 옮겨내고 isoprophanol을 첨가해 주는데 isoprophanol은  핵산류를 침전시켜 RNA 를 농축, 침전 시켜주는 역할을 한다.
rna 분리 의 마지막단계로 depc water 를 첨가해 주는이유는 RNase 때문인데 이 RNase 는 단일나선의 RNA 를 분해시키는 RNA 분해효소로 RNA 가 파괴될 위험이 있으므로 넣어주는것이다.
DEPC는 histidine을 선택적으로 alkylation시키는 물질이다. 대부분의 RNase들의 active site에는 Histidine이 있고 따라서 DEPC는 효과적으로 RNAse를 inactivation시킬 수 있는 것이다.
이에 RNA 관련된 실험에 쓰이는 물이나 buffer등에 DEPC가 많이 쓰인다.
단 아민기가 많은 Tris Buffer등에는 사용할 수 없는 점에 주의하여야 합한다.
다른 효소들 그리고 RNA에 영향을 줄 수 있기 때문에 DEPC를 처리한 물은 대개 DEPC를 제거해야 한다. 사실 DEPC는 물속에서 Half-life가 30분정도 밖에 되지 않고 그 산물역시 EtOH 와 CO2 이기때문에 Autoclave등으로 (0.5-1 hr) 쉽게 제거할 수 있다. DEPC를 처리한 용액에서 향긋한 냄새가 나는데 이것은 DEPC용액내의 불순물들로 인한 부산물인 에테르 이기때문이다.
DEPC 처리 이외에도 autoclave, baking, RNA work 만을 위한 용기를 사용함으로서 RNAase로부터 RNA를 보호할 수있다.
세포가 파괴되면서 나오는 endogenous RNase 방지로는
Guanidine HCl, Guanidinium thiocyanate : potent denaturing agent로 세포의 파괴와 RNase inhibition이 동시에 이루어진다.
rna 분리후 cDNA 합성에서는 oligo DT 를 사용하게되는데 우리가 분리해 낸 RNA 에는 A 사슬이 많이나오는데 oligo DT 에는 T 사슬이 많이있어 RNA 를 인지하는 primer 로서 사용된다. 여기에서 incubation 을 65도씨~70도씨에서 10분간 incubation , ice 에서 10분간 incubation 하게 되는데 ice 에서 10분간 넣어두어야 뭉쳐있던 RNA 가 풀리게 되기 때문이다
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암세포와 정상세포

정상세포는 G1 S G2 M 기를 거치며 복제와 분열을 거듭한다 세포주기단계를 신호하는것은 사이클린 의존성 키나아제(Cdk) 라 불리는 단백질 종류의 할성화에 기인한다. 그러나 암세포에서는 사이클린-Cdk의 조절이 손상되어있다. 예를 들면 매우 빨리 생장하는 유방암 세포는 사이클린 D를 매우 많이 갖고 있고, 이것이 Cdk4를 과대 자극시켜 결과적으로 세포분열이 많아지게 한다. 정상세포에서 분열을 억압하는 주된 단백질은 p53이다. 이 p53은 p21을 합성하게 하고 그로 인해 Cdk를 억압한다. 사람 암 중의 절반 이상은 손상된 p53을 갖고 있고, 그 결과 세포주기 조절이 없게된다. 그러나 계속증식하는 암세포의 특성을 이용하여 단일클론항체를 만들어 이용할 수 있다.

 

cell과 cell line

 

세포는 동물에서 떼어 내어 일차, 이차, 삼차 등등 계속하여 배양할 수 있다. 이러한 배양을 계대배양이라 하는 데, 대부분의 세포들은 이러한 계대배양을 계속할 경우 어느 정도 배양하다 보면 더 이상 증식되지 않고 세포들이 죽게 된다. , 대부분의 세포는 무한정 계대배양할 수 있는 것이 아니다. 이러한 현상을 배양 중인 세포의 노화 (culture senescence)라고 부르는 데, 이는 살아있는 생명체의 생명이 유한한 것과 같은 것이다. 그러나, 세포를 배양하다보면 세포 중에 돌연변이가 나타나 일부 세포의 성질이 변하는 경우가 있다. 이러한 변화 중에는 세포를 보다 오랜 기간 계대배양할 수 있게 되는 경우있을 수 있는데, 이렇게 변화된 세포를 세포주 (cell strain)이라고 부른다. 또한 이들 세포주 중에는 더 많은 변화가 유도되어 무한정 계대배양할 수 있는 세포가 생기기도 하는 데, 이러한 세포를 세포선 (cell line)이라고 부른다. 이들 세포주나 세포선들은 상업적으로 판매되기도 하며, 시험관에서 계속하여 배양이 가능하다.

 

 

세포배양

생물체의 조직으로부터 분리된 세포를 배양하는 것으로 식물에서는 캘러스 일부를 액체배양하거나 동식물의 종양 세포를 배양하는 일이 흔하다. 세포배양으로 얻은 세포군이 경우에 따라서는 1개의 개체로 생장하기도 한다.

 

방법,

세포 배양을 위해서는 먼저 동물로부터 특정한 조직을 떼어내고, 이 조직을 잘게 부순 다음, 단백질 분해효소를 이용하여 세포와 세포를 연결해주는 결합단백질을 파괴하여 서로 서로 잘 분리된 세포 현탁액을 준비한다. 그 후 이 세포 현탁액을 적절한 배지에 넣어 주어 세포를 배양하면 된다.

일차배양은 동물로부터 기관 (organ)이나 조직 (tissue)을 떼어낸 다음, 세포를 분리하여 배양접시에 바로 배양한 것을 말한다. 이들 세포들은 배양접시에서 계속하여 배양하게 되면 스스로 죽어나가게 되어 무한정 계속 배양할 수 있는 세포는 아니기 때문에 계속하여 배양하려면 주기적으로 다시 세포를 준비하여야 한다. 또한 임프구형 세포를 제외한 세포들은 배양접시에 세포들이 부착하여 성장을 하게 되는데, 이들 세포들은 계속하여 성장하다 보면 새로 증식한 세포들도 계속하여 배양접시에 부착하여 증식하게 되어 결국에는 배양접시 바닥에 세포들이 다닥다닥 붙어있는 세포의 단층 (monolayer)로 자라게 된다. 이러한 배양을 일차배양이라 하며, 이때가 되면 세포들은 더 이상 부착할 곳이 없는 상태가 되어 증식을 멈추게 된다. 이러한 세포들을 계속하여 증식하게 하려면 세포의 일부를 배양접시에서 떼어내어 새로운 배양접시에 넣고 배양하여야 한다. 이러한 배양을 이차 배양 (secondary culture)이라고 하는 데, 이 경우도 세포가 단층으로 가득 자라게 되면 다시 성장을 멈추게 되므로 계속 세포를 배양하기 위해서는 세포를 계속하여 옮겨줄 필요가 있다.

세포가 단층으로 자라고 멈추기 때문에 배양접시에서 세포를 떼어내어 새로운 배양접시에서 배양하는 방법으로 세포를 증식시킨다.

조직에서 세포를 떼어내어 배양하게 되면, 조직 중에 존재하는 모든 세포들이 균일하게 잘 자라는 것이 아니다. 이 경우 많은 세포 종류 중에서 시험관 배양에서 비교적 잘 자라는 세포들이 쉽게 얻어지기 때문에, 원하는 세포를 얻기 위해서는 특별한 조처가 필요하며, 원하는 세포가 얻어졌는지를 언제나 확인하여야 한다.

 

배양 장비

도립현미경(Inverted Microscopy)

세포배양시 항상 세포의 모양을 관찰해야 하므로 현미경은 반드시 필요한 장비이다.

배양기 안에서 배양하고 있는 세포를 관찰하기 위하여 광원이 위에 있고,

대물렌즈가 아래에 있는 도립현미경을 갖추는 것이 좋고 배율은 40-200배 정도라면 적당하다.


  CO2 incubator

동물 세포 배양 기간 동안 배양 배지내 pH는 일정 수준으로 유지되어야 한다. 일반적으로 액상 배지의

한 성분인 NaHCO3 CO2 기체와의 평형에 의해 배지의 pH가 조절된다. 따라서 동물 세포 배양에는

CO2 incubator가 필수적이다.

세포배양에 사용되는 CO2 incubator의 대부분은 water jacket 형으로서 문의 개폐에 따르는 온도변화가 작고

복귀속도도 빠르다.

Incubator 내부 가장 아래에는 배지의 습기 증발을 막기 위해서 가습 vat가 있어야 하며

늘 멸균수를 채워 넣어 내부 습도를 100%로 유지한다.

CO2 incubator는 고온다습하여 잡균의 오염가능성이 크다. 따라서 무균 상태를 유지하도록 주의해야하며

자주 청소할 필요가 있다.

Incubator의 내부는 1% SDS로 닦고 건조시킨 후 70% ethanol로 다시 한번 닦아낸다.

또한 가습용 vat의 물은 멸균수를 사용하고 방부제로 methyl p-hydroxybenzoic acid를 적당한 양으로 첨가하면 좋다.


  Clean bench

Clean bench는 무균조작을 위한 작업대이며, HEPA filter 및 송풍기를 사용하여 무균공기를

항상 내부로 보낸다.

Clean bench 내부에는 형광등과 자외선 살균등이 설치되어 있어야 하며, 사용하지 않을 때에는

항상 살균등을 켜놓아야 한다. 사용한 후에는 작업대를 70% ethanol로 닦아야 한다.

Clean bench 내에는 세포배양에 필요한 여러장비, , autopipettor, aspirator

(배양액을 원심분리한 후 배양상청액을 흡취하는데 사용한다), forceps, micropipetter,

burner, pipette (1ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, etc.)등을 둔다. 일반적으로 burner pipette

배지 병의 입구등을 화염멸균할 때 사용하지만 무균조작 자체를 신중히 하면 화염멸균이 반드시 필요한 것은 아니다.


  
초순수 물 제조장치

동물세포의 배양, 특히 무혈청배양에 사용하는 물의 순도는 매우 중요하다.

그러므로 동물세포를 실험할 때 사용하는 물을 고도로 정제하는 장치는 필수품이다.

JBI에서는 세포배양에 필요한 초순수물(JBI, Cat. No. LS 016-01)을 판매하고 있다.


  
배양 용기

유리제와 플라스틱제가 있다. 부유세포의 경우에는 유리제와 플라스틱제의 어느 쪽에도 문제가 없으나,

접착세포의 경우 유리제에 collagen, poly-D-lysine, fibronectin 등의 접착인자를 coating하는

전처리 과정이 필요하다.

플라스틱제 배양기는 일반적으로 일회용으로서 세척, 멸균 등의 작업이 필요없다.

플라스틱제 배양기는 dish, flask, microwell plate, roller bottle 등의 여러가지 크기와 형상이 있으며

각각의 특징을 아래 표에 나타내었다.

Tissue culture vessels

Growth area (cm2)

Medium volume (ml)

*1X trypsin or
  1X trypsin-EDTA solution Volume (ml)

  Microwell plates

 

 

 

  96 well

  0.32

  0.3

  0.3

  24 well

  2.0

  0.5 - 1.0

  0.5

  12 well

  3.8

  1 - 2

  1

  6 well

  9.6

  2

  1

  Culture Dishes

 

 

 

  35 mm

  9.6

  2

  1

  60 mm

  21

  5

  2

  100 mm

  55

  10

  5

  150 mm

  145

  20-30

  8

  Flasks

 

 

 

  25 cm2 (T-25)

  25

  5 - 10

  2

  75 cm2 (T-75)

  75

  15 - 30

  5

  175 cm2 (T-175)

  175

  30 - 50

  8

  225 cm2 (T-225)

  225

  50 - 70

  15

  Roller Bottles

 

 

 

  1250 ml

  490

  100 - 200

  -

  2200 ml

  850

  100 - 250

  -

  4900 ml

  1750

  100 - 500

  -

  * 1X trypsin: contains 0.25% porcine trypsin (1:250)

  * 1X trypsin-EDTA: contains 0.05% porcine trypsin (1:250) and 0.53 mM EDTA·4Na


  
액체 질소 보존통

세포의 장기 보존을 위해서는 액체 질소 보존통이 필수품이다.

액체 질소 보존법에는 액체 질소 용액 내 보존(-196°C)과 액체 질소 증기 내 보존(-120°C)이 있다.

액체질소 용액 내 보존은 액체질소가 동결앰플(ampule) 내에 침투할 경우 바이러스 등의 오염의 원인이 되고,

해동시에는 앰플내의 액체질소가 기화하여 폭발할 위험이 있다.

이러한 이유로 액체질소 용액 내에 보존을 할 경우 silicone rubber packing이 붙어 있는

플라스틱제의 cryotube를 사용하든가, 유리앰플에 봉합하여 사용하는 것이 바람직하다.

액체 질소 보존법은 거의 반영구적으로 보존이 가능하지만 일년에 한번은 해동하여 배양하고 다시 동결하도록 한다.

액체질소는 기화하여 감소하기 때문에 정기적으로 보충할 필요가 있다.

 

 

 

 

배양액

cell culture 쓰는 기본적 media ( 실험에 따라 달라질 수있습니다. )

1. 기본합성배지
  1>
아미노산 ; 세포의 단백합성의 원료로 성장과 생장에 이용/ 글루타민을 주로 이용
  2>
비타민 ; 세포활성을 유지에 필요 / 혈청 첨가 배지는 혈청속에 포함
  3>
무기염류 ; 세포의 기능 발현 조절
  4>
당류 ; glucose 이용
  5>
탄산수소나트륨 ; 배지의 pH 유지

2. 혈청
  1>
단백분해효소의 활성 억제
  2> FBS(
소태아혈청), CBS(어린 소혈청), BS(어린소혈청)
  3> Serum
사용하기 전에 inactivation 이라는 전처리

  4> Serum
56°C 에서 30 동안 가열하여 serum 속에 존재하는 항체
       complement
불활성화 시키는
 
       inactivation
과정 단백질 변성이 있을 있으므로 필요한 경우가 아니면 생략

3. 항생제 : 세균증식 억제

 

HIB5 세포 현미경 관찰


 

cell counting 방법

 

토의

이번실험은  HiB5 라는 세포를 배양한 것을 추출하여 cell counting 까지 하는것이었다.

hib5는 쥐의 해마에서 추출한 세포이며 32도씨에서 배양하여야한다. 39도씨에서는 뉴런으로 분화하기때문에 세포배양시 주의해야한다. Hib5는 배양했을시 바닥에 붙어자란다.

사용하는 배지는 H-DMEM 으로 10% FBS. 1x antibiotics 가 포함된 배지인데 10% FBS 는 송아지에서 추출한 것으로 혈청이 들어있다. 그리고 세포들을 떨어뜨리기 위해 trypsin- edta 를 첨가 하였을때 trypsin의 작용을 억제하는데 이는 fbs안에는 많은 단백질이 있기때문에 상대적으로 세포의 단백질에 작용하는 trypsin의 양이 줄어들기 때문이다. 그리고 이 media 의 색깔이 붉은것은 phenol red 라는 지시약이 media 내에 있기때문인데 이 지시약이 ph 중성일때 자주빛을 띄기 때문이다.

먼저 media를 제거한후 완충작용을 하는 pbs buffer로 washing 해준다음 trypsin -edta 300마이크로리터를 마이크로피펫으로 넣어주는데 이 trypsin - edta 는 세린계 단백질 분해효소로써 지금까지 나와있는 효소 중에서 가장 specific하면서 가장 정확하게 자르는 위치만 자르는데 그 위치는 Arg과 Lys의 뒤쪽이다.

Trypsin-EDTA는 트립신을 녹인 용액에 EDTA까지 들어간 것으로

PBS에 0.25%가 되게 Trypsin을 녹이고 1mM이 되게 EDTA를 녹여 사용하는것이 일반적이다.

세포배양시 trypsin을 사용하는 경우는 배양접시 바닥에 붙어 자라는 세포에만 해당한다.EDTA는 chelate로 Ca2+같은 다가 이온을 붙잡는 역할을 한다.

세포부착에 관여를 하는 단백질중에 cadherin같은 단백질은 부착을 하기 위해서는 Ca2+가 필요하다. 그렇기 때문에 EDTA를 첨가해서 Ca2+를 제거해주면 cadherin같은 분자의 기능을 억제하기 때문에 trypsin과 같이 사용하여 세포를 떨어뜨리기가 더 용이해진다.

incubation 3분 완전배지 300마이크로리터를 넣어준후 e-tube로 옮겨 원심분리를 하는데, 원심분리를 하고나면 우리가 필요한 세포들은 크기가 크고 무거워 침전되기때문에 필요없는 sup 을 제거해준다. 이때 세포까지 제거하지 않도록 주의하여야 한다.

cell counting을 하는데 25칸중 한칸의 크기 0.1mm x 0.1mm x 0.1mm = 0.1mm3승 =ml (1ml는 0.001마이크로리터) 로 한칸의 세포수를 센 후 칸수인 25을 곱하여 세포수 x 25 x 10의4승 으로 세포수를 계산한다. 세포를 셀때에는 칸중 2줄로 되어있는 칸인 작은칸의 세포를 센다.

이 세포들을 사용하여 다음 실험에도 사용할 것이기 때문에 영하 80도씨에서 보관하였다.


- cell counting 방법에 대한 토의 내용은 오류가있음 참고

Posted by 찬재
TAG 암세포

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  1. 조교

    Reference는 어디있죠?

    2011.04.06 22:26 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]
    • 사자책이랑 잡다한책들인데 2년전에쓴거라 자세하겐 기억안나네요. 근데 왜 저한테 레퍼런스를 물으시죠? 잭히넴? 나에겐 잭히넴의 아이피가 있다 121.176.195.100

      2011.04.07 01:32 신고 [ ADDR : EDIT/ DEL ]
  2. 슬퍼서 우는거 아니야..바람이 불어서 그래..눈이 셔서..

    2013.04.24 20:13 [ ADDR : EDIT/ DEL : REPLY ]