암세포와 정상세포 차이, cell line, 세포배양 (cell counting , cell harvest)

암세포와 정상세포

정상세포는 G1 S G2 M 기를 거치며 복제와 분열을 거듭한다 세포주기단계를 신호하는것은 사이클린 의존성 키나아제(Cdk) 라 불리는 단백질 종류의 할성화에 기인한다. 그러나 암세포에서는 사이클린-Cdk의 조절이 손상되어있다. 예를 들면 매우 빨리 생장하는 유방암 세포는 사이클린 D를 매우 많이 갖고 있고, 이것이 Cdk4를 과대 자극시켜 결과적으로 세포분열이 많아지게 한다. 정상세포에서 분열을 억압하는 주된 단백질은 p53이다. 이 p53은 p21을 합성하게 하고 그로 인해 Cdk를 억압한다. 사람 암 중의 절반 이상은 손상된 p53을 갖고 있고, 그 결과 세포주기 조절이 없게된다. 그러나 계속증식하는 암세포의 특성을 이용하여 단일클론항체를 만들어 이용할 수 있다.

 

cell과 cell line

 

세포는 동물에서 떼어 내어 일차, 이차, 삼차 등등 계속하여 배양할 수 있다. 이러한 배양을 계대배양이라 하는 데, 대부분의 세포들은 이러한 계대배양을 계속할 경우 어느 정도 배양하다 보면 더 이상 증식되지 않고 세포들이 죽게 된다. 즉, 대부분의 세포는 무한정 계대배양할 수 있는 것이 아니다. 이러한 현상을 배양 중인 세포의 노화 (culture senescence)라고 부르는 데, 이는 살아있는 생명체의 생명이 유한한 것과 같은 것이다. 그러나, 세포를 배양하다보면 세포 중에 돌연변이가 나타나 일부 세포의 성질이 변하는 경우가 있다. 이러한 변화 중에는 세포를 보다 오랜 기간 계대배양할 수 있게 되는 경우있을 수 있는데, 이렇게 변화된 세포를 세포주 (cell strain)이라고 부른다. 또한 이들 세포주 중에는 더 많은 변화가 유도되어 무한정 계대배양할 수 있는 세포가 생기기도 하는 데, 이러한 세포를 세포선 (cell line)이라고 부른다. 이들 세포주나 세포선들은 상업적으로 판매되기도 하며, 시험관에서 계속하여 배양이 가능하다.

 

 

세포배양

생물체의 조직으로부터 분리된 세포를 배양하는 것으로 식물에서는 캘러스 일부를 액체배양하거나 동식물의 종양 세포를 배양하는 일이 흔하다. 세포배양으로 얻은 세포군이 경우에 따라서는 1개의 개체로 생장하기도 한다.

 

방법,

세포 배양을 위해서는 먼저 동물로부터 특정한 조직을 떼어내고, 이 조직을 잘게 부순 다음, 단백질 분해효소를 이용하여 세포와 세포를 연결해주는 결합단백질을 파괴하여 서로 서로 잘 분리된 세포 현탁액을 준비한다. 그 후 이 세포 현탁액을 적절한 배지에 넣어 주어 세포를 배양하면 된다.

일차배양은 동물로부터 기관 (organ)이나 조직 (tissue)을 떼어낸 다음, 세포를 분리하여 배양접시에 바로 배양한 것을 말한다. 이들 세포들은 배양접시에서 계속하여 배양하게 되면 스스로 죽어나가게 되어 무한정 계속 배양할 수 있는 세포는 아니기 때문에 계속하여 배양하려면 주기적으로 다시 세포를 준비하여야 한다. 또한 임프구형 세포를 제외한 세포들은 배양접시에 세포들이 부착하여 성장을 하게 되는데, 이들 세포들은 계속하여 성장하다 보면 새로 증식한 세포들도 계속하여 배양접시에 부착하여 증식하게 되어 결국에는 배양접시 바닥에 세포들이 다닥다닥 붙어있는 세포의 단층 (monolayer)로 자라게 된다. 이러한 배양을 일차배양이라 하며, 이때가 되면 세포들은 더 이상 부착할 곳이 없는 상태가 되어 증식을 멈추게 된다. 이러한 세포들을 계속하여 증식하게 하려면 세포의 일부를 배양접시에서 떼어내어 새로운 배양접시에 넣고 배양하여야 한다. 이러한 배양을 이차 배양 (secondary culture)이라고 하는 데, 이 경우도 세포가 단층으로 가득 자라게 되면 다시 성장을 멈추게 되므로 계속 세포를 배양하기 위해서는 세포를 계속하여 옮겨줄 필요가 있다.

세포가 단층으로 자라고 멈추기 때문에 배양접시에서 세포를 떼어내어 새로운 배양접시에서 배양하는 방법으로 세포를 증식시킨다.

조직에서 세포를 떼어내어 배양하게 되면, 조직 중에 존재하는 모든 세포들이 균일하게 잘 자라는 것이 아니다. 이 경우 많은 세포 종류 중에서 시험관 배양에서 비교적 잘 자라는 세포들이 쉽게 얻어지기 때문에, 원하는 세포를 얻기 위해서는 특별한 조처가 필요하며, 원하는 세포가 얻어졌는지를 언제나 확인하여야 한다.

 

배양 장비

도립현미경(Inverted Microscopy)
	세포배양시 항상 세포의 모양을 관찰해야 하므로 현미경은 반드시 필요한 장비이다.
	배양기 안에서 배양하고 있는 세포를 관찰하기 위하여 광원이 위에 있고,
	대물렌즈가 아래에 있는 도립현미경을 갖추는 것이 좋고 배율은 40-200배 정도라면 적당하다.
	CO2 incubator
	동물 세포 배양 기간 동안 배양 배지내 pH는 일정 수준으로 유지되어야 한다. 일반적으로 액상 배지의
	한 성분인 NaHCO3와 CO2 기체와의 평형에 의해 배지의 pH가 조절된다. 따라서 동물 세포 배양에는
	CO2 incubator가 필수적이다.
	세포배양에 사용되는 CO2 incubator의 대부분은 water jacket 형으로서 문의 개폐에 따르는 온도변화가 작고
	복귀속도도 빠르다.
	Incubator 내부 가장 아래에는 배지의 습기 증발을 막기 위해서 가습 vat가 있어야 하며
	늘 멸균수를 채워 넣어 내부 습도를 100%로 유지한다.
	CO2 incubator는 고온다습하여 잡균의 오염가능성이 크다. 따라서 무균 상태를 유지하도록 주의해야하며
	자주 청소할 필요가 있다.
	Incubator의 내부는 1% SDS로 닦고 건조시킨 후 70% ethanol로 다시 한번 닦아낸다.
	또한 가습용 vat의 물은 멸균수를 사용하고 방부제로 methyl p-hydroxybenzoic acid를 적당한 양으로 첨가하면 좋다.
	Clean bench
	Clean bench는 무균조작을 위한 작업대이며, HEPA filter 및 송풍기를 사용하여 무균공기를
	항상 내부로 보낸다.
	Clean bench 내부에는 형광등과 자외선 살균등이 설치되어 있어야 하며, 사용하지 않을 때에는
	항상 살균등을 켜놓아야 한다. 사용한 후에는 작업대를 70% ethanol로 닦아야 한다.
	Clean bench 내에는 세포배양에 필요한 여러장비, 즉, autopipettor, aspirator
	(배양액을 원심분리한 후 배양상청액을 흡취하는데 사용한다), forceps, micropipetter,
	burner, pipette (1ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, etc.)등을 둔다. 일반적으로 burner는 pipette과
	배지 병의 입구등을 화염멸균할 때 사용하지만 무균조작 자체를 신중히 하면 화염멸균이 반드시 필요한 것은 아니다.
	초순수 물 제조장치
	동물세포의 배양, 특히 무혈청배양에 사용하는 물의 순도는 매우 중요하다.
	그러므로 동물세포를 실험할 때 사용하는 물을 고도로 정제하는 장치는 필수품이다.
	JBI에서는 세포배양에 필요한 초순수물(JBI, Cat. No. LS 016-01)을 판매하고 있다.
	배양 용기
	유리제와 플라스틱제가 있다. 부유세포의 경우에는 유리제와 플라스틱제의 어느 쪽에도 문제가 없으나,
	접착세포의 경우 유리제에 collagen, poly-D-lysine, fibronectin 등의 접착인자를 coating하는
	전처리 과정이 필요하다.
	플라스틱제 배양기는 일반적으로 일회용으로서 세척, 멸균 등의 작업이 필요없다.
	플라스틱제 배양기는 dish, flask, microwell plate, roller bottle 등의 여러가지 크기와 형상이 있으며
	각각의 특징을 아래 표에 나타내었다.
	Tissue culture vessels Growth area (cm2) Medium volume (ml) *1X trypsin or   1X trypsin-EDTA solution Volume (ml)   Microwell plates         96 well   0.32   0.3   0.3   24 well   2.0   0.5 - 1.0   0.5   12 well   3.8   1 - 2   1   6 well   9.6   2   1   Culture Dishes         35 mm   9.6   2   1   60 mm   21   5   2   100 mm   55   10   5   150 mm   145   20-30   8   Flasks         25 cm2 (T-25)   25   5 - 10   2   75 cm2 (T-75)   75   15 - 30   5   175 cm2 (T-175)   175   30 - 50   8   225 cm2 (T-225)   225   50 - 70   15   Roller Bottles         1250 ml   490   100 - 200   -   2200 ml   850   100 - 250   -   4900 ml   1750   100 - 500   -
	* 1X trypsin: contains 0.25% porcine trypsin (1:250)
	* 1X trypsin-EDTA: contains 0.05% porcine trypsin (1:250) and 0.53 mM EDTA·4Na
	액체 질소 보존통
	세포의 장기 보존을 위해서는 액체 질소 보존통이 필수품이다.
	액체 질소 보존법에는 액체 질소 용액 내 보존(-196°C)과 액체 질소 증기 내 보존(-120°C)이 있다.
	액체질소 용액 내 보존은 액체질소가 동결앰플(ampule) 내에 침투할 경우 바이러스 등의 오염의 원인이 되고,
	해동시에는 앰플내의 액체질소가 기화하여 폭발할 위험이 있다.
	이러한 이유로 액체질소 용액 내에 보존을 할 경우 silicone rubber에 packing이 붙어 있는
	플라스틱제의 cryotube를 사용하든가, 유리앰플에 봉합하여 사용하는 것이 바람직하다.
	액체 질소 보존법은 거의 반영구적으로 보존이 가능하지만 일년에 한번은 해동하여 배양하고 다시 동결하도록 한다.
	액체질소는 기화하여 감소하기 때문에 정기적으로 보충할 필요가 있다.

 

 

 

배양액

※ cell culture에 쓰는 기본적 media ( 실험에 따라 달라질 수있습니다. )

1. 기본합성배지
  1> 아미노산 ; 세포의 단백합성의 원료로 성장과 생장에 이용/ 글루타민을 주로 이용
  2> 비타민 ; 세포활성을 유지에 필요 / 혈청 첨가 배지는 혈청속에 포함
  3> 무기염류 ; 세포의 기능 발현 조절
  4> 당류 ; glucose 이용
  5> 탄산수소나트륨 ; 배지의 pH 유지

2. 혈청
  1> 단백분해효소의 활성 억제
  2> FBS(소태아혈청), CBS(어린 소혈청), BS(어린소혈청)
  3> Serum은 사용하기 전에 inactivation 이라는 전처리
  4> Serum을 56°C 에서 30분 동안 가열하여 serum 속에 존재하는 항체 및
       complement를 불활성화 시키는 것 
       inactivation 과정 중 단백질 변성이 있을 수 있으므로 꼭 필요한 경우가 아니면 생략

3. 항생제 : 세균증식 억제

 

HIB5 세포 현미경 관찰

 

cell counting 방법

 

토의

이번실험은  HiB5 라는 세포를 배양한 것을 추출하여 cell counting 까지 하는것이었다.

hib5는 쥐의 해마에서 추출한 세포이며 32도씨에서 배양하여야한다. 39도씨에서는 뉴런으로 분화하기때문에 세포배양시 주의해야한다. Hib5는 배양했을시 바닥에 붙어자란다.

사용하는 배지는 H-DMEM 으로 10% FBS. 1x antibiotics 가 포함된 배지인데 10% FBS 는 송아지에서 추출한 것으로 혈청이 들어있다. 그리고 세포들을 떨어뜨리기 위해 trypsin- edta 를 첨가 하였을때 trypsin의 작용을 억제하는데 이는 fbs안에는 많은 단백질이 있기때문에 상대적으로 세포의 단백질에 작용하는 trypsin의 양이 줄어들기 때문이다. 그리고 이 media 의 색깔이 붉은것은 phenol red 라는 지시약이 media 내에 있기때문인데 이 지시약이 ph 중성일때 자주빛을 띄기 때문이다.

먼저 media를 제거한후 완충작용을 하는 pbs buffer로 washing 해준다음 trypsin -edta 300마이크로리터를 마이크로피펫으로 넣어주는데 이 trypsin - edta 는 세린계 단백질 분해효소로써 지금까지 나와있는 효소 중에서 가장 specific하면서 가장 정확하게 자르는 위치만 자르는데 그 위치는 Arg과 Lys의 뒤쪽이다.

Trypsin-EDTA는 트립신을 녹인 용액에 EDTA까지 들어간 것으로

PBS에 0.25%가 되게 Trypsin을 녹이고 1mM이 되게 EDTA를 녹여 사용하는것이 일반적이다.

세포배양시 trypsin을 사용하는 경우는 배양접시 바닥에 붙어 자라는 세포에만 해당한다.EDTA는 chelate로 Ca2+같은 다가 이온을 붙잡는 역할을 한다.

세포부착에 관여를 하는 단백질중에 cadherin같은 단백질은 부착을 하기 위해서는 Ca2+가 필요하다. 그렇기 때문에 EDTA를 첨가해서 Ca2+를 제거해주면 cadherin같은 분자의 기능을 억제하기 때문에 trypsin과 같이 사용하여 세포를 떨어뜨리기가 더 용이해진다.

incubation 3분 완전배지 300마이크로리터를 넣어준후 e-tube로 옮겨 원심분리를 하는데, 원심분리를 하고나면 우리가 필요한 세포들은 크기가 크고 무거워 침전되기때문에 필요없는 sup 을 제거해준다. 이때 세포까지 제거하지 않도록 주의하여야 한다.

cell counting을 하는데 25칸중 한칸의 크기 0.1mm x 0.1mm x 0.1mm = 0.1mm3승 =ml (1ml는 0.001마이크로리터) 로 한칸의 세포수를 센 후 칸수인 25을 곱하여 세포수 x 25 x 10의4승 으로 세포수를 계산한다. 세포를 셀때에는 칸중 2줄로 되어있는 칸인 작은칸의 세포를 센다.

이 세포들을 사용하여 다음 실험에도 사용할 것이기 때문에 영하 80도씨에서 보관하였다.


- cell counting 방법에 대한 토의 내용은 오류가있음 참고