일반생물학실험 요점 정리

실험 1. 배지의 종류,제조 및 멸균.

배지의정의

배지: 적당량의 영양성분을 혼합해서 미생물을 생존시키고 지속적으로 증식시키기 위해서 인공적으로 증식환경이 만들어진 상태, 미생물을 생육시키기 위한 각종 영양소의 혼합물을 말한다.

LB 배지: Luria-Bertani media에서 앞글자만 따서 LB 배지라고 한다. 미생물을 키울때 가장 일반적으로 쓰이는 배지로서 Tryptone 10g, yeast extract 5g, sodium chloride 10g 을 증류수 1L 에 녹인후 멸균(가압 멸균 121℃ 1.5기압에서 15분 정도)후에 60℃정도로 식혀서 사용하면 된다. 단 ,우리가 실험한 LB 배지는 고체 배지로써 pertidish 에 정도 차게끔 부어준후 말려서 사용한다. ( 배지를 부을때는 Clean bench에서 알콜로 소독해가면서 pertidish 에 말려 쓴다)

세균을 배양 할때 뒤집어서 배양하는 이유는 자라나는 미생물들이 밑부분부터 차오른다고 생각할수 있는데 그렇게 되면 윗부분에 세포들이 영양 섭취가 어렵게 되므로 중력에 의한 어느정도 자란 세포들에게 영양분이 아래로 떨어지도록 하기위해 뒤집어 놓는다. 또한 물방울이 평판위에 떨어지는 것을 방지하기 위해서이기도 하다.

실험2. 현미경 사용법 및 세포 관찰
양파 프레파라트 만들어 관찰.

쥐 대장과 피부: 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin) 으로 염색 한것. 헤마톡실린은 염기성 물질로서 세포핵을 보라색으로 염색시키는 염료이고, 에오신은 산성물질로 세포질을 적색으로 염색하는 염료이다. hematoxylin - eosin 염색을 합쳐서 HE 염색이라고하며 흔히 routine 염색이라고 한다.  염색방법은 조직을 헤마톡실린으로 염색후 세포질 바깥구조 대비를 위해 에오신으로 대조염색한다. 핵속에도 단백질이 있어 에오신의 염색되나 헤마톡실린의 진한 푸른색 때문에 염색이 안 된 것같이 보인다. 헤마톡실린의 염색속도가 빠르기 때문에 염색후 재빠르게 물로 잘 수세해야 한다.

현미경 관찰시 주의점: 대물대위에 프레파라트 놓고 조동나사로 경통 조절할때는 접안렌즈를 보면서 조절하는 것이 아니라 직접 눈으로 확인하면서 렌즈와 프레파라트의 거리를 잰다. 왜냐하면 접안렌즈만 보면서 조절하다가는 프레파라트와 대물렌즈가 부딪혀서 프레파라트가 깨어질수도 있기 때문이다.

저배율에서 고배율로 전환시 더욱 좁은곳을 넓게 보는 것으로 인해 들어오는 빛의 양이 그만큼 작아지는 것을 의미 하므로 주위가 어두어지기 때문에 해상도가 떨어지게 된다.

실험3. 양파세포분열 관찰, Mitosis Meiosis 구별

Mitosis (유사분열 = 체세포 분열): 유사분열은 하나의 세포가 2n 개의 염색체를 가졌을 경우 염색체가 n개인 2개의 세포로 분열한 다음 그 2개의 세포가 커지면서 염색체가 원래의 수인 2n 개로 성장한다. 즉, 감수분열은 반씩인 것이 2개가 합쳐져서 하나로 되고 유사분열은 1객 2개로 나누어진다음 커지는 것이다.  스텝별로 나누면 Interphase(간기), prophase( 전기), metaphase(중기), anaphase(후기), telophase(말기) 로 나눌수 있다.

Meiosis (감수분열): 감수분열은 감수분열 이전의 체세포가 갖고 있는 염색체의 에 해당되는 염색체를 가진 배우자 세포들이 형성되는 세포분열 방식이다. 두 번의 핵분열이 연속적으로 진행되어 이루어진다. 첫 번째 감수분열이 진행되는 동안 서로 나란히 배열되는 염색체 쌍을 상동염색체 라고 한다. 제1감수분열에서는 이 상동염색체 쌍이 서로 분리되어 두 개의 서로다른 핵 속으로 나뉘게 된다. 제2 감수분열은 염색체의 복제 없이 각 염색체의 염색분체가 서로 다른 딸핵으로 분리되어 일어난다. 결과적으로 2번의 분열에서 4개의 딸세포가 형성된다.

양파 세포 분열 관찰: 양파뿌리를 잘라 고정액 (formaldehyde 10%) 에 담구어 fixing 한다. 1N HCl을 56℃로 가열 후 양파뿌리를 8분간 넣어둔다. (해리) 70% ethanol로 washing 후 slide glass 위에 양파뿌리를 잘라 올리고 잘게 찢는다. 아세트산 카민 한방울떨어뜨려서(핵 붉은색 염색됨) Cover glass 덮고 여과지를 덮어 근단표면을 세게 눌러 완전히 편후 현미경으로 관찰한다.

뿌리부분 관찰한 이유는 뿌리 끝에 세포분열이나 생장을 활발하게 하는 생장점이 있어서 유사분열을 쉽게 관찰 할 수 있기 때문이다.

염색의원리: 전하의 원리에 의해 이루어 진다. 핵은 인산 때문에 음의 전하를 띠게 되는데 염색약이 양의 전하를 갖기 때문에 결합함으로써 착색이 이루어지는 것이다.  고정은 세포의 함유된 여러 종류의 효소가 있어 고정을 하지 않으면 효소가 작용해서 세포를 분해하여 형태나 구조 등이 변형 될 수 있기 때문에 이러한 효소를 불활성 시킴으로써 세포를 살아있는 상태와 유사하게 유지할 수 있다.

실험4. 쥐의 해부

해부실험용 쥐로 B6 사용하였다. 경추탈골법을 이용 쥐를 죽인후 쥐의 외부형태를 보고  알코올로 쥐를 닦은후 해부대에 고정시키고 핀셋으로 복부아래쪽 피부를 집어 들어 올리고 해부가위로 전개후 소화계, 순환계, 호흡계, 비뇨생식계, 등의 위치와 형태를 관찰 한다.

실험5. 쥐 에서 spleen and lymph-node  분리 및 관찰
쥐의 spleen을 분리후 갈아서 PBS 를 첨가후 원심분리시킨다 가라앉은 RBC, WBC남기고 위에 있는 PBS 제거한후 RBC lysis buffer 를 첨가하여 RBC를 파괴, 원심분리한다 파괴된 RBC와 RBC lysis buffer 를 제거한다.  PBS로 다시한번 원심분리후(남아있는 RBC lysis buffer 제거하기 위하여 : WBC 에도 영향을 미치므로...) WBC만 남은 것을 희석하여 hemacytometer 위에 올리고 관찰한다.

hemacytometer에서 세포의 개수 알아내는 법

한 칸당 평균 세포의 수 = 25칸 중 몇칸을 세어 평균을 낸다.
25칸에 있는 세포의 수 = 평균낸것 
1에 있는 세포의 수는 25칸에 들어있는 세포수  
5에 있는 세포수(총세포수) =  1에 있는 세포수

PBS:  등으로 이루어져있고 세포주변을 적절한 이온세기로 만들어주는데  생리식염수와 비슷하다 (등장액 역할을 한다.) PBS를 사용하지 않고 물을 사용하면 아마  용혈현상이 생길 것이다.

1안에  있는 세포수: 세포수 이 되는 이유는 9개의 큰 칸은 가로세로 1mm, 이고 커버그라스를 씌운후 사이공간의 높이가 0.1mm 가 되어서  총 부피가 0.0001이 되므로 0.0001mL 의 부피와 같기 때문에   을 해주어야 1ml부피의 세포수를 알수 있다.

실험 6. 생체세포에서 생분자 분리및 관찰

PCR(Polymerase Chain Reaction): 특정 DNA부분을 특이적으로 반복 합성하여 시험관 내의 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법 아주 적은 양의 DNA 를 이용 많은 양의 DNA 합성이 가능.

5분 정도  90~96℃ demonstration 하여 단일가닥으로 분리 
10초 정도 50~60℃ annealing 하여 가닥에 primer  첨가
30초~1분간 70~74℃에서 extension

위의 cycle 이 1 cycle 인데 이 과정을 여러번 반복해서 원하는 양만큼을 얻는다.
이를 보관할 때는 4℃에서 영구 보관 할수 있고  final extension 2~5분간 시행후 전기영동한다.
 
PCR에 필요한것은 CDNA, Primer 2개, dNTP, Tag Polymerase 가 필요한데 CDNA를 고온처리(90~96℃)하면 변형이 일어나 단일가닥으로 나뉘는데, Tag Polymertase는 심해 화산지형에 서식하는 고온에서 강한 박테리아의 것을 뽑아서 사용함으로  변형이 일어나지 않는다. 

실험 7. 구강내 충치 세균 배양

Synder 배지 이용 구강내 충치세균 배양하여 관찰.

Synder 배지: 구강내 많은 양의 산을 형성하는 세균을 검정하는데 사용되는 배지로서 탄수화물원인 포도당과 pH지시약인 brom cresol green 을 포함한다. 배지의 도말전 pH는 4.8로서 수강에 많은 lactobacilli가 존재하면 포도당이 대사물질로 이용되어 pH가 감소한다.
배지의 색이 노란색으로 변할수록 구강에 존재하는 세균이 더 많다는 것을 의미.
탄수화물은 발효하면 유기산과 젖산으로 바뀌고 젖산이 에나멜질을 없애서 치아를 푸석하게 만들고  설탕은 중합 반응을 통하여 글루칸과 과당으로 바뀌는데 이것이 플라그를 형성하여 젖산이 나오게된다.

실험 8. 단백질 분리.

SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel electrophoresis)

단백질이 단위체인지 중합체인지 결정할때와 소중합체를 구성하는 소단위체들의 수와 크기를 결정할 때 유용하게 사용된다.
실험 순서 요약

① Protein을 SDS Page 한다.
② Transfer : nitro cellurose(membrane) antibody는 풀라스틱에 반응 그래서 protein 만 얻기 위해서 blocking 한다.
③ Blocking 5%의 skin milk 로 적당히(너무 많이하면 단백질까지 덮어버려 밴드가 안나오고  적게 하면 씻겨 내려가서  antibody 보임.)

④ 1st antibody 
⑤ washing : 0.05% TBS tween 20 : 세제성분 (미세부분 걸러짐)
⑥ 2nd antibody
⑦ washing
⑧ film 고정
⑨ developing
SDS PAGE 과정

SDS PAGE 첫 단계에서는 단백질이 고유 3차 구조 잃고 linear 상태가 되어 분자량에 따라 분리가 된다. 두 번째 nitro cellulose 같은 filter에 transfer 한다. 이렇게 하는동안 protein 으로부터 SDS 제거되고 protein 의 구조가 재생되면서 원래 항원 결정기를 가지게 되는데 transfer 되는 과정동안 이동효율은 분자량에 달려있다. 작은 단백질이 큰 단백질보다 효율이 떨어진다. 이는 메탄올 처리함으로 소수성 결합을 강화 시켜 membrane 에 잘 결합하도록 한다.
Coomisie brilliant blue 염색 원리
염색염료 Coomisie brilliant blue 가 쓰인다. 이는 일차적으로 basic amino acid 에 결합하고 이외에 aromatic amino acid 와도 binding 하는 것으로 알려져있다.
따라서 비특이적으로 protein 과 결합해 electrophoresis 된 gel 을 staning 후 distaining 과정에서 protein 을 제외한 나머지부분은 distaning 되고 protein은 푸른색으로 남게 되는 것이다.

Western blot
1) 특징
생체 용액에 있는 개개의 단백질 성분을 분리하는 데 기본적인 기술
2) 원리
- 여러 가지 단백질을 포함하고 있는 세포 또는 조직의 추출물을 전기 영동하여 그 속에 들어있는 단백질을 크기 별로 구분한 다음 흡착지에 옮겨 놓고 조사하고자 하는 단백의 항체와 결합시켜 그 단백의 존재 유무와 크기 등을 밝히는 검사이다.
- Western blot은 다른 말로 면역블롯팅(immune blotting)이라고도 부른다.