MIC 측정

MIC 는 세균에 대한 항생제의 최소 저해 농도를 의미합니다.

즉, 다시말하면 세균에게 최소한 어느 정도 양의 항생제를 주어야 생장이 억제되느냐, 그때의 항생제의 농도를 구하는 것이죠.

항생제에는 수많은 종류가 있고, 세균에는 더 많은 종류가 있습니다.

그런데 항생제라고 해서 모든 세균에 적용되는 것은 아니고,

각 항생제의 작용부위와 기작에 따라서 저해할 수 있는 세균이 있고,

그렇지 못한 세균이 있습니다.

예를 들면, 유명한 페니실린(penicillin)과 같은 경우는 세포벽 합성을 억제함으로 항균작용을 하는데, 세포벽이 peptidoglycan으로 두껍게 되어있는 그람 양성균의 경우에는 페니실린에 의해서 잘 듣지 않습니다. 다른것을 사용해야죠.

그리고 세균의 일반적인 특성 중의 하나가, 항생제에 대하여 쉽게 내성을 가진다는 점입니다. 실험을 하게 되시면 알겠지만, 불과 반나절 사이에 내성을 가진 돌연변이체가 생기는 것을 보실 수 있습니다. MIC 실험은 이러한 면에서 적절한 양의 항생제를 투여하기 위한 기초실험으로도 생각할 수 있습니다.

 

MIC 실험과정은 다음과 같습니다.

먼저 여러개의 균주를 overnight 배양해서 튼실하게 준비합니다.

그리고 항생제를 준비하고, 액체배지를 여러개 플라스크에 준비하여 항생제를 여러 농도로 각각 넣지요.

그리고 각 단위시간(1시간 또는 30분) 간격으로 OD를 측정하고 plate에 깔아서 CFU를 잽니다.

그래프를 그려서 각 농도별로 비교해보면 최소 저해농도를 알 수 있습니다.

2. Determination of the activity

2.1 Inhibitory activity

일반적으로 MIC를 측정함

MIC(minimal inhibitory concentration): 미생물의 생육을 저해하는데 필요한 최저 농도

방법

1.Mueller Hinton broth를 사용하여 액체 배지를 만듬.

2.10개의 튜브를 준비하여 한 개는 4ml, 나머지는 2ml씩 배지를 채움.

3.따로 2.와 같이 10개 만듬.

4.균을 희석하기 위한 배지를 만듬.

5.고압증기 멸균 후 2의 튜브들에 항생제 첨가.

6.튜브에서 2ml씩을 옮겨 2배씩 희석.

7.대장균의 농도를 희석하여 저농도의 튜브에서부터 대장균을 이식.

8.incubation

9.균이 자라지 않는 최소 최소 농도를 측정.

[출처] MIC(Minimum Inhibitory Concentration)|작성자 하드발레

1. MIC 측정 방법

- Test tube를 series로 준비하고 시험균주가 접종된 동일량의 배지를 분주, Inoculum은 103 - 106 cells/ml tube, microwell을 보통 사용하기도 함

- 시험하고자하는 항생제의 농도를 조정(일반적으로 1/2 단계적 농도로 함, 즉 stepwise 2-fold dilution으로, 예: 128, 64, 32, 16 mg/ml), positive control(항생제 무첨가) 필요

- 시험균주의 생육적온에서 배양, 생육에 충분한 시간 동안, 10 -15 generation time(보통 o/n) 정도

- 육안으로 생육 여부를 관찰, 탁도(turbidity)는 적어도 107 cell/ml tube를 나타냄, “last" clear tube의 항생제 농도가 MIC

이와같이 MIC는 stepwise 2-fold dilution과 visual determination 방법을 사용함으로 아주 정확한 방법은 아님, 그러나 항생제 연구와 임상에 있어서 아주 유용한 parameter로 사용되고 있음, 시험균주에 따라(예: species), 실험조건에 영향을 받음

2. 고체 배지상에서의 측정방법

액체 배지상에서와 기본적으로 동일, 109 cells/ml 정도의 시험균주(피검균)가 함유된 MH(Mueller-Hinton, Difco) 배지를 기본으로 반합성배지를 주로 사용. 배양 후에 균 생육 여부를 관찰. 한 번(1 plate)에 여러 시료에 대한 MIC 측정이 가능

- 농도 : 100 ㎍/ml로부터 2배 희석(100, 50,2 5, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56, 0.78, 0.39, 0.20, 0.10, 0.05, 0.025 등). 100 ㎍/ml 이상인 경우에는 200, 400, 800, 1,600 ㎍/ml으로

- Inoculum(접종균액) : 약 106 cells/ml, 장기간 보존한 균주를 사용할 때는 적어도 1회이상 계대 배양하고 계대 배양 직후의 균을 사용. 37℃에서 18-20시간 정도 배양하면 S. aureus 209P와 E. coli NIHJ 균주의 경우 108-109 cells/ml에 달함

 

얼빵하신 조교님이 직접하신 실험이라 실험결과가 제대로 안나옴...

이번실험은 mic측정으로 mic는 세균에 대한 항생제의 최소 저해 농도 로서 세균의 생장을 막는데 필요한 최소한의 농도를 찾는데에 있다.
mic 측정방법중 고체배지를 이용한 방법과 액체배지를 이용한 방법을 사용하였는데 먼저 고체배지를 이용한 실험부터 시행하였다.
고체배지를 이용한 방법으로는 페트리접시에 배지와 박테리아를 도말하고 3개의 칸을 나누어 각각 다른 항생제를 투여한다. 이 때 알코올 램프 근처에서 실험을 진행하여 무균의 상태에서 진행하여야 다른균에 의한 잘못된 결과 가 생기지 않는다. 또 로더를 이용한 도말을 시행할 시 너무 세게 문지르면 배지가 찢어질 수 있으므로 조심한다.
항생제를 넣고 하룻밤 culture 한다. 배양중인 페트리접시는 뒤집어서 보관하는데 이는 중력에 의하여 박테리아들이 골고루 분포시키기 위함이다.
박테리아가 항생제에 내성을 가지고 있다면 항생제를 뭍힌 종이 근처에도 박테리아가 자라나고,
내성을 가지고 있지 않으면 항생제를 뭍힌 종이 근처에는 둥그렇게 박테리아가 자라지않는 공간이 생긴다. 해당 항생제에 감수성이 좋은
박테리아 일수록 박테리아가 자라지 않는 반경원이 커진다. 그리고 그 넓이를 계산하는 것이다. 그러나 우리 실험을 비롯한 모든 조의 실험에서 실험시 무언가 빠뜨린게 있어
제대로된 결과가 나오지 않았다.
그리고 액체배지를 이용한 실험은 각각 5개의 코니컬 튜브에 다른농도의 항생제를 넣고 박테리아가 자라나는지 확인하는것인데.이 역시 모든 농도의 튜브에서 박테리아가 생장하여
항생제에 내성을 가지고 있는것으로 생각된다.