DNA Hybridization (DNA 혼성화)

 

 

 

 

 

1.     DNA Hybridization (DNA 혼성화)

서로 다른 두개의 핵산가닥이 상보적 결합을 형성하는 것

pH, 온도, salt 에 따라 결합되는 정도가 달라진다.

 

두 가닥내의 인산기 사이에 정전기적 반발이 없어질 정도로 염의 농도가 높아 야 한다. 대개 0.15-0.50M NaCl이 사용된다.

온도는 한 가닥 내에서 이루어지는 임의의 수소결합이 다시 파괴될 정도로 높아야 한다. 그러나 너무 높아서도 안되고, 가닥간의 안정된 염기쌍이 이루어질 정도로 낮아서도 안된다. 재생을 위한 최적온도는 Tm보다 20-25℃ 낮아야 한다.

재생속도는 나선이 다시 꼬이는 시간에 의하여 좌우되는 것이 아니라, 상보적인 두 가닥 사이에서 염기쌍이 정확하게 일어날 수 있도록 두 가닥이 접근할 수 있는 확률에 의존한다. 이것은 오직 임의의 운동결과이기 때문에, 재생기간은 농도에 의 해 좌우된다.

 

혼성화의 방법

혼성화반응은 예비혼성화 반응과 혼성화반응의 2단계로 이루어진다.

 

1. 예비혼성화 반응

막의 크기에 맞는 양의 예비 혼성화 반응 용액을 넣고 막이 용액에 완전히 적셔지도록 한 다음 42℃, 2~3시간 반응시킨다.

 

2. 혼성화 반응

예비 혼성화 반응 용액을 버린다. 혼성화 반응 용액에 끓는 물중에서 변성시킨 후 급냉한 탐침을 첨가한 다음 막에 부어준다.

1~2시간 반응시킨 다음 100℃로 가열한 탐침을 첨가하여 잘 혼합하고 65℃에서 하룻밤 혼성화 반응시킨다. 혼성화 반응 용액 중 덱스트란 설페이트는 혼성체 형성속도를 증가시키는 목적으로 또 Denhardt 용액이나 청어 정자 DNA는 백그라운드를 낮게 억제하는 목적으로 첨가하고 있다. 혼성화 반응에서 온도는 매우 중요한 조건으로 탐침의 융해온도(Tm)는 탐침과 상보적 배열인 혼성체의 50%가 해리하는 온도이다.

 

Southern Blot hybridization,

Genomic DNA에 존재하는 특정 유전자의 위치는 Southern(1975)이 고안한 transfer 방법을 통하여 결정할 수 있다. 이 방법은 genomic DNA를 하나 혹은 여러가지 제한효소로 자른 다음 생성된 각 DNA 조각을 agarose gel 전기영동하여 크기별로 분리한 후, gel 상에서 DNA를 변성시키고 gel로부터 solid support(흔히 nitrocellulose 혹은 nylon membrane)으로 이동시킨다. 이렇게 gel로부터 membrane으로 이동될 때 DNA조각들의 상대적인 위치는 유지되게 된다. Membrane에 부착된 DNA는 방사선 동위원소 혹은 비방사선 물질로 표지된 DNA 혹은 RNA(probe이라 부름)와 hybridization되고 자가방사법등을 통해 그 위치를 가시화하게 된다. 이러한 기술은 genomic DNA 뿐만 아니라 plasmid의 분석, cosmid, bacteriophage 등의 분석에도 적합한 방법이 될 수 있다.

Northern Blot hybridization

전기영동이 끝난 후 크기에 따라 전개된 RNA를 nylon membrane(HybondTM-N; Amersham, UK)에 이동시킨다. Glyoxal 존재하에 전기영동된 RNA의 경우 곧바로 nylon membrane에 transfer해도 되지만 formaldehyde를 함유한 gel의 경우 transfer하기 전에 증류수로 수차례 세척하여 formaldehyde를 완전히 제거하여야 한다. 또한 gel 농도가 1% 이상이거나 gel 두께가 0.5 cm 이상, 또한 분석하고자 하는 RNA의 크기가 2.5 kb 이상인 경우 0.05 N NaOH에 gel을 약 10여분 담가 놓는다. 이렇게 함으로써 RNA를 부분적으로 절단하게 되어 transfer의 효율을 높이게 된다. Gel은 0.1 M Tris-Cl, pH 7.5 용액에 30분간 담고 다시 20x SSC 용액(3 M NaCl, 0.3 M sodium-citrate, pH 7.3)에 약 30분 가량 담가둔 후에 transfer 준비를 한다. RNA의 transfer 방법은 DNA의 경우와 거의 유사하다. Membrane에 RNA의 결합을 더욱 증가시키기 위하여 변형된 형태인 positively-charged nylon membrane을 사용할 수도 있다. 그러나 이를 사용하면 방사선 동위원소를 이용한 probe에는 background가 지나치게 높아서 비방사선 동위원소를 사용하는 경우 주로 사용한다.

 

Colony Hybridization

Genomic DNA library란 수많은 종류의 유전자를 함유하고 있는, 문자 그대로 유전자를 모두 가지고 있는 유전자 도서관이라고 할 수 있다. 즉 조그마한 1.5 ml 크기의 microcentrifuge tube에 담겨 있는 genomic DNA library 용액내에는 수백만가지의 서로 다른 유전자를 함유한 vector가 섞여 있는 것이다. 이 library에서 우리가 원하는 특정 유전자를 함유하고 있는 vector를 선별하여 한가지 종류의 유전자만을 함유하는 - 단일한 종류의 - vector를 보유하게 되는 일련의 과정이 gDNA cloning이다.

 

Dot (Slot) Blot Hybridization

 

서던블롯에 비하여 간단하며 상대적으로 시간과 노동이 절약되고 수십개의 검사를 동시에 실시할 수 있는 장점 때문에 선별검사로 유용하지만 위양성율이 높다.

방사성 동위원소를 사용하기 때문에 임상 유용성이 낮다.

 

 

2. the amount of human chromosomal DNA in a human individual

사람의 세포수를 100조개로 두고, 한 세포당 chromosome이 46개 존재하고, 46개의 chromosome의 염기쌍이 약 60억bp이며, bp당 분자량은 660Da이다. 따라서

100조 x 60억 x 660 = 396,000,000,000,000,000,000,000,000Da

(396x10^24 Da ) 이다.

하지만 이거슨 맞는지 잘 모르겠.....ㅋㅋㅋ