bacteria 의 transformation

introduction
transformation은 유전자가 삽입된 플라스미드 vector를 대장균세포속으로 도입하는 과정이다.
형질전환이 연구는 그리피스의 죽은 병원성 폐렴쌍구균의 DNA가 비병원성 폐렴쌍구균을 병원성으로 전환시키는것을 확인한 실험에서부터 시작되었다.
형질전환은 small DNA보다 large DNA 의 효율이 떨어지며 DNA의 양이 너무 많아도 좋지 않으므로 적당한 길이와 적당한 양의 DNA를 사용하는것이 중요한 요소이다.

natural transformation
- 몇 몇 박테리아는 특별한 처리 없이 DNA를 교환한다.
-single strand dna

artifical transformation
-single and double strand dna
- chemical treatment
 -> 외부자극을 주어 dna가 들어갈 수 있게 해준다. (Heat Shock)
-Electroporation

method

1. competent cell 과 dna를 ice 에서 녹인다.
2.cpcell 100ul + dna 1ul ice 5min
3. 37도c에서 heat shock 5min
4. LB media 1ml 넣고 recovery 40min
5. cell 을 100ul씩 따서 LA plate 에서 spreading
6. 37도c에서 배양 16h
7. colony 따서 LA media에 배양 37도c 16h


result

discussion
이번실험은 박테리아의 transformation 으로 dna를 e-coli 세포 내로 주입하는 실험이었다.
transformation을 하게되면 외부로부터 주어진 dna에 의하여 e-coli의 유전적인 성질이 변하게 되고, e-coli의 doubleing 시간은 20분으로 매우 짧기 때문에 다량의 dna를 얻을 수 있는 효과도 있다. dna를 e-coli의 dna 사이로 끼워 넣기 위해서 외부로부터 물리적 혹은 화학적 충격을 가해주어야 하는데, 우리는 cacl2를 처리하여 세포벽을 약하게 만들어 competent cell을 만들고,  heat shock 로 e-coli의 세포 내부로 dna가 들어가 e-coli의 유전적 성질이 변하게 하였다. cacl2를 처리하게되면 열에민감하게 되어 상온에서 damage를 받게되므로 ice에서 5min 처리해주어야 한다. heat shock 후 40분간 배양하는것은 heat shock 에 의해 damage를 받은 e-coli를 e-coli의 doubleing 시간인 20분을 2번 거쳐 세포 수를 늘리기 위함이다.  e-coli를 사용한 것은 e-coli는 유전적 변이가 잘 일어나지 않기때문에 transformation 후 여러번의 replication 에도 우리가 원하는 유전자를 보존할 수 있기 때문이다.
유전자를 운반해주는 vector의 조건으로는 크기가 작고, 복제시작점이 존재해서 replication이 되어 다음 e-coli에도 유전자가 존재하게 되고, MCS (multiple cloning site)가 존재해서 제한효소의 site로 유전자가 들어갈 수 있어야 하고, screening을 위해 항생제 내성을 가지고 있어야 한다. e-coli 에 유전자가 들어갔다면 엠피실린이 들어있는 la배지에서도 생존가능 하므로 plate에 존재하는 colony는 transformation 된 것이다.

reference
생명 생물의 과학 /purves 외 4인/ 교보문고/257p