plasmid DNA preporation

plasmid DNA preporation

cell 80ul를 e-tube에 준비
centrifuge 14000RPM 5min
상층액 제거
pellet에 sol.1 200ul add. 상온 5min
고루 섞이도록 vortex 후 상온 5min
sol.2 400ul add
inverting 15회 상온 5min
sol.3 300ul add
inverting 15회 상온 5min
centrifuge 14000RPM 10min 4'c
상층액을 다른 tube로 900ul옮긴다
isopropanol 600ul add
상온 5min
centrifuge 14000RPM 15min 4'c
상층액 제거
70% EtOH 1ml add
centrifuge 14000RPM 10min
EtOH 제거
overdry
TDW+RNase 20ul add

agarose gell 만든 후 전기영동kit에 dna prep에서 얻은 DNA를 넣고 TAE buffer를 넣고 전기장을 걸어준다.

이번실험은 plasmid DNA prep 후 전기영동을 통해 transformation 된 DNA를 찾아내는 것이다.
Plasmid DNA prep기본적인 원리는 세균의 cell wall과 cell membrane을 부수고 DNA 만을 분리하는 것이다.
이 때 중요한 것은 세균이 원래 가지고 있는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 구분하여 분리하는 것이다. 이 둘은 모두 DNA이므로 성질이 비슷하기 때문에 구분하여야 하는데 chromosomal DNA는 분리 과정에서 linear 형태가 되고 크기가 상당히 크기 때문에 이런 성질의 차이를 이용하면 분리할 수 있다.
dna prep 과정 중 sol.1에는 glucose, Tris-Cl, EDTA가 들어있는데, EDTA는 세포막의 마그네슘과 결합하여 세포벽을 약화시키는 역할을 하고, glucose는 삼투압을 유지시켜주어 약화된 세포벽을 가진 세포가 파괴되지 않도록 외형을 유지시켜준다. 만약 이 과정에서 세포가 완전히 깨지게 되면 chromosomal DNA가 잘게 깨지게 되어 plasmid DNA와 구분할 수 없게 된다. 따라서 세포를 유지시키기 위해 glucose는 필수적이다.
sol.2는 ionic detergent로 세포막을 깨는 일을 한다.  NaOH, SDS가 들어있고, NaOH는 pH를 12이상으로 만들어주어 chromosomal DNA, 단백질, plasmid를 변성시킨다.
그리고 SDS는 Cell을 lysis시키고 단백질을 변성시킨다.
 그 다음 sol.3는 renature 시키는 단계인데, potassium acetate, glacial acetic acid가 들어있다.높은 농도의 salt와 acetic acid에 의해 pH가 낮아지면 변성된 단백질과 chromosomal DNA가 재생되는데,이 때 size가 큰 단백질과 chromosomal DNA는 정확히 재생되지 못하고 엉키게 되며, plasmid는  renaturation된다.
또한 potassium에 의해 soluble한 SDS가 insoluble한 potassium dodecyl sulfate가 되어 변성된 단백질과 chromosomal DNA와 함께 insoluble complex를 형성한다.
이렇게 분리한 DNA를 DNA절편을 전기영동한다. 전기영동은 + charge를 걸어주어 - charge를 가진 dna를 크기별로 분리해 주는데, glycerol이 분자량이 크고 무겁기 때문에 DNA를 가라앉게 한다. 전기영동 시 sample은 투명하기 때문에 보이지 않는데, 때문에 bromophenol blue 를 넣어주어 전기영동의 진행상황을 확인 할 수있고, 영동 후에는 EtBr이 uv 하에서 발광하는 성질을 이용해 uv에서 결과를 확인한다.  크기별로 전개되는 전기영동의 특성을 이용 하기 때문에, transformation 된 것의 DNA는 되지 않은 것의 DNA의 전개결과와 결과가 다른 것을 확인 함으로써 transformation 된 DNA를 확인 할 수 있다. 하지만 우리조의 경우 dna preporation 과정중 DNA를 버리는 바람에 결과가 전혀 나오지 않았다.