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대학 과제 및 리포트/유전학 실험-생물학과

bacteria 의 transformation

by 찬재 2009. 11. 13.
introduction
transformation은 유전자가 삽입된 플라스미드 vector를 대장균세포속으로 도입하는 과정이다.
형질전환이 연구는 그리피스의 죽은 병원성 폐렴쌍구균의 DNA가 비병원성 폐렴쌍구균을 병원성으로 전환시키는것을 확인한 실험에서부터 시작되었다.
형질전환은 small DNA보다 large DNA 의 효율이 떨어지며 DNA의 양이 너무 많아도 좋지 않으므로 적당한 길이와 적당한 양의 DNA를 사용하는것이 중요한 요소이다.



natural transformation
- 몇 몇 박테리아는 특별한 처리 없이 DNA를 교환한다.
-single strand dna

artifical transformation
-single and double strand dna
- chemical treatment
 -> 외부자극을 주어 dna가 들어갈 수 있게 해준다. (Heat Shock)
-Electroporation

method

1. competent cell 과 dna를 ice 에서 녹인다.
2.cpcell 100ul + dna 1ul ice 5min
3. 37도c에서 heat shock 5min
4. LB media 1ml 넣고 recovery 40min
5. cell 을 100ul씩 따서 LA plate 에서 spreading
6. 37도c에서 배양 16h
7. colony 따서 LA media에 배양 37도c 16h


result


discussion
이번실험은 박테리아의 transformation 으로 dna를 e-coli 세포 내로 주입하는 실험이었다.
transformation을 하게되면 외부로부터 주어진 dna에 의하여 e-coli의 유전적인 성질이 변하게 되고, e-coli의 doubleing 시간은 20분으로 매우 짧기 때문에 다량의 dna를 얻을 수 있는 효과도 있다. dna를 e-coli의 dna 사이로 끼워 넣기 위해서 외부로부터 물리적 혹은 화학적 충격을 가해주어야 하는데, 우리는 cacl2를 처리하여 세포벽을 약하게 만들어 competent cell을 만들고,  heat shock 로 e-coli의 세포 내부로 dna가 들어가 e-coli의 유전적 성질이 변하게 하였다. cacl2를 처리하게되면 열에민감하게 되어 상온에서 damage를 받게되므로 ice에서 5min 처리해주어야 한다. heat shock 후 40분간 배양하는것은 heat shock 에 의해 damage를 받은 e-coli를 e-coli의 doubleing 시간인 20분을 2번 거쳐 세포 수를 늘리기 위함이다.  e-coli를 사용한 것은 e-coli는 유전적 변이가 잘 일어나지 않기때문에 transformation 후 여러번의 replication 에도 우리가 원하는 유전자를 보존할 수 있기 때문이다.
유전자를 운반해주는 vector의 조건으로는 크기가 작고, 복제시작점이 존재해서 replication이 되어 다음 e-coli에도 유전자가 존재하게 되고, MCS (multiple cloning site)가 존재해서 제한효소의 site로 유전자가 들어갈 수 있어야 하고, screening을 위해 항생제 내성을 가지고 있어야 한다. e-coli 에 유전자가 들어갔다면 엠피실린이 들어있는 la배지에서도 생존가능 하므로 plate에 존재하는 colony는 transformation 된 것이다.

reference
생명 생물의 과학 /purves 외 4인/ 교보문고/257p