돌연변이원(mutagen)

▶Chemical mutagens

돌연변이 원으로서 알려진 많은 화학물질 중의 하나는 nitrous acid이다. Figure 8.17은 DNA가 nitrous acid에 노출되었을 때 Adenine의 base pair가 Thymine대신 Cytosine으로 전환되는 방법을 나타낸다. 변형된 Adenine을 가진 DNA가 복제되면 하나의 daughter DNA는 그의 parent DNA와는 다른 base pair sequence를 갖게 된다. 결국 granddaughter cell에서는 일부 A-T base pair가 G-C base pair로 바뀔 것이다. nitrous acid는 DNA의 특정한 base pair를 변화시킨다. 모든 돌연변이 원과 같이 nitrous acid는 무작위적 위치에서 DNA를 변형시킨다.

또 다른 화학적 돌연변이 원은 base analog 이다. 이러한 물질은 구조적으로 보통의 nitrogenous bases와 유사하다. 그래서 그들은 base pair의 특성을 약간 변형시킨다. 예를 들면 2-aminopurine과 5-bromouracil과 같은 것이 있다. 2-aminopurine분자는 adenine의 자리에서 DNA로 합성되지만 cytosine과 짝할수 있다. 5-bromouraci분자는 thymine의 자리에서 DNA로 합성되지만 guanine과 짝할수 있다. base analog가 성장세포에 주어지면 analog는 보통의 base 자리에서 DNA를 무작의적으로 합성한다. 그리고 나서 DNA가 복제되면 analog는 base pair에서 실수를 유발한다. 잘못 짝지어진 base는 DNA가 복제되는 동안 복사되어서 그 결과 progeny cell에서 base pair substitution이 일어난다. 일부 항바이러스제와 항암제는 base analog 이다.

다른 화학적 돌연변이 원은 소규모의 deletion이나 insertion을 유발해서 frameshift의 결과를 가져온다. 예를 들면 어떤상태의 담배연기와 매연에 있는, benzpyrene은 영향력있는 framshift mutagen이다. 또 Aspergillus flavus에서 생산되고 땅콩과 곡식의 낟알에서 자라는 곰팡이인 aflatoxin도 framshift mutagen으로서 herpes virus에 대항하는 acridine dye로 사용된다. framshift mutagen은 DNA의 이중가닥에 차곡차곡 쌓인 염기를 밀어내기 위해서 항상 같은 크기와 같은 화학적 특성을 갖는다. framshift mutagen은 DNA의 두 가닥을 조금 파생시키거나 하나의 가닥에서 gap이나 bulge를 지나면서 작업할 것이다. 변형된 DNA가 DNA합성동안 복제되면 새로운 DNA에서는 하나 또는 두 개의 base pair가 첨가되거나 삭제될 것이다. 또한 framshift mutagen은 때로는 영향력있는 발암물질이기도하다.

▶Radiation

Xray와 gamma ray는 영향력있는 돌연변이원인 방사선을 형성한다. 왜냐하면 그들은 원자와 분자를 이온화시키기 때문이다. 이온화시키는 방사선의 침투선은 전자를 그들의 일상의 껍질에서 벗어나게 한다. 영향받은 전자는 다른 분자에 충격을 주고 해를 주어서 그 결과 많은 이온과 free radical이 매우 반응성있게 된다. 이러한 이온의 일부는 DNA의 염기와 결합할 수 있고 그 결과 DNA복제와 수리에서 돌연변이가 발생할 수 있다. 좀 더 심각한 결과는 DNA의 sugar- phosphate backbone의 공유결합을 분열시켜 염색체에 물리적인 분열을 야기시킨다.

돌연변이 유발성 방사선의 또 다른 형태는 자외선이다. 일상의 태양빛은 비 이온화성 빛이지만 가장 영향력있는 빛은 오존층에 투과되는 빛이다. DNA에 직접적인 UV가 노출되면 thymine근처에 thymine dimer를 형성할 수 있다. 그러한 수리되지 않은 dimer는 세포에 심각한 손상이나 죽음을 유도할 수 있다. 왜냐하면 그것은 DNA의 복제나 전사를 저해하기 때문이다.

박테리아와 다른 개체들은 radiation demage를 교정할수 있는 효소를 갖고 있다. 가시광선의 존재하에서 photoreativating enzyme은 UV선에의해 형성된 손상을 고치기위해 light excision repair를 수행할수 있다. 이러한 효소는 빛에너지를 사용하여 thymine dimer와 결합해서 dimer의 결합을 쪼개서 thymine nucleotides를 재구성한다. dark excision repair는 Figure 8.19에 나타난다. 효소가 넓은 gap을 열면서 뒤틀린 thymine을 자른다. 그리고 나서 손상받지 않은 가닥과 상보적으로 새롭게 합성된 DNA로 그 gap을 채운다. 이렇게 원래의 base-pair sequence는 재건된다. 마지막 단계는 DNA ligase에 의해서 DNA의 backbone을 공유적으로 봉합하는 것이다. 때때로 그러한 수리과정은 문제를 발생시켜 원래의 base-pair sequence가 완전히 재건되지 못하게 한다. 이 문제의 결과가 돌연변이이다. 사린이 UV선에 노출되면 피부세포에 많은 수의 thymine dimer가 생긴다. 이러한 dimer의 수리는 피부암의 발생에 기여하고 다른 돌연변이를 축적하게 한다.

〈Frequency of Mutation〉

mutation rate는 세포가 분열할 때 유전자가 돌연변이 될 수 있는 가능성을 나탸낸다. rate는 항상 10²으로 일정하다. 왜냐하면 돌연변이는 매우 드물게 일어나며 지수는 항상 음수이기 때문이다. 예를 들면, 만약에 세포가 분열할때 1/10000만큼 돌연변이가 발생한다면 그것은 10⁴으로 나타낸다. DNA복제에서 자연발생적인 실수는 매우 낮은 빈도로 발생한다. 아마 복제된 base pair의 10⁹에서 한 번정도로 발생한다.(mutation rate는 10⁹이다.) 평균유전자가 10³ base pair이기 때문에 자연발생적인 돌연변이율은 복제된 유전자의 1/10⁶이다.

돌연변이는 항상 염색체를 따라 무작위적으로 발생한다. 낮은 빈도의 random mutation의 발생은 그들의 환경에서 종의 적응성에 필수적이다. 왜냐하면 진화는 어느정도의 유전적 다양성이 무작위적이고 낮은 빈도로 발생하기를 원하고 있기 때문이다. 예를 들어, 박테리아에서 size를 나타내는 population은 항상 매 세대에서 발생한다. 대부분 돌연변이는 해롭고 세포가 죽을 때 유전자에서 제거되어야 하지만 일부 돌연변이는 세포에 유익하다. 예를 들어, 항생물질에 저항성을 갖는 돌연변이는 박테리아의 population이 항생물질에 노출되었을때에 유리하다. 그러한 형질은 돌연변이를 통하여 나타났으며 세포는 돌연변이된 유전자를 전달하여 다른 세포보다 더 잘 생존하고 복제할 수 있게 된다. population에서 곧 대부분의 세포는 그 유전자를 갖게된다. 돌연변이원은 항상 자연발생적인 mutation rate를 증가시킨다. 돌연변이원이 있으면 복제된 유전자당 1/10⁶의 mutation rate가 1/10³이나 1/10⁵으로 된다. 돌연변이원은 미생물의 유전적 특성에 관한 연구에서 돌연변이 세포의 생산을 증가시키기 위해서 실험적으로 사용된다.

〈Identifying Mutants〉

돌연변이는 변형된 표현형을 testing하거나 selecting하는 방법에 의해서 알 수 있다. 돌연변이원이 사용되거나 되지 않던 특정한 돌연변이를 가진 돌연변이 세포는 항상 population에서 다른 세포와 비교된다.

실험은 다른 개체보다 박테리아에서 쉽게 행해질수 있다. 왜냐하면 박테리아는 빨리 복제되고 그래서 많은 수의 개체를 쉽게 사용할 수 있다. 게다가 박테리아는 일반적으로 세포당 각 유전자의 하나의 복사본을 갖기 때문에 돌연변이된 유전자의 영향력은 많은 진핵생물에서와 같이 유전자의 전위에의해서 숨겨질수 없다.

Postive selection은 돌연변이 되지않은 parent cell의 거부에 의해서 돌연변이 세포를 알수 있는 방법이다. 예를 들어 우리가 penicillin에 저항성을 가진 돌연변이 박테리아를 찾는다고 가정해보자. 박테리아 세포를 penicillin이 포함된 배지에서 키우면 그 돌연변이는 바로 알아볼 수 있다. 돌연변이 population은 성장해서 colonies를 형성하는 반면 penicillin-sensitive parental cell은 성장할 수 없다.

다른 돌연변이 감식법은 negative selection이다. 이 과정은 특정한 기능을 수행할수 없는 세포를 선택하는 방법이다. 이것은 또한 replica-plating기술을 사용한다. 예를 들어 우리가 histidine을 합성할 능력을 상실한 박테리아세포를 확인하기위해서 replica-plating을 사용한다고 가정해보자. master plate라고 하는 이 plate는 모든 세포가 성장할 수있는 histidine을 배지에 포함한다.배양기에서 몇시간이 지난후에 각각의 세포는 복제하여서 colony를 형성한다. 그리고 나서 살균한 velvet pad로 master plate위를 누른다. 그러면 각각의 colony로부터 일부세포가 velvet에 부착된다. 다음에 velvet을 두 개 또는 그이상의 멸균된 plate위에 놓고 누른다. 하나의 plate는 histidine을 배지에 갖고 있으며 또 다른 하나의 plate는 histidine을 배지에 포함하지 않는다. 어떤 colony는 master plate위의 histidine을 가지고 배지에서 자라지만 histidine을 합성할 수 없는 colony는 histidine이 없는 배지에서 성장할 수 없다. 돌연변이 colony는 master plate에서 확인될 수 있다. 물론, 돌연변이가 매우 드물기 때문에 많은 plate는 특정한 돌연변이를 동정하기위해서 이기술로 심사되어야 한다.

replica-plating기술은 하나 또는 그 이상의 새로운 성장 인자를 요구하는 돌연변이를 동정하기위해서는 매우 효과적인 방법이다. parent에게는 소유되지 않은 영양요구물을 소유하는 어떤 돌연변이 미생물을 auxotroph이라고 한다. 예를 들면 auxotroph은 특정한 아미노산을 합성하는데 필요한 효소가 없을지도 모른다. 그러나 그것의 영양배지에서 성장인자로 그 아미노산을 요구할 것이다.

〈Identifying Chemical Carcinogen〉

많이 알려진 돌연변이 원은 carcinogen으로 알려져 있다. 그것은 사람과 동물에서 암을 일으키는 물질이다. 최근 몇년동안 환경, 작업장, 음식물에서의 화학물질은 사람에게 암의 원인으로 암시되어져왔다. 해로운 carcinogen을 결정하는 테스트에 유용한 지표는 동물이고 테스트하는 과정은 시간이 많이 소비되며 비싸다. 현재는 빠르고 덜 비싼 방법을 사용하고 있다. 그 중의 하나가 Ames test로서 carcinogen지표물로 박테리아를 사용한다.

Ames test는 돌연변이 박테리아를 돌연변이 유발물질에 노출시켜 원래의 돌연변이를 역으로해서 새로운 돌연변이를 야기시키는 관찰에 기본을 둔다. 이러한 과정을 back-mutation or reversion이라고 한다. 테스트는 돌연변이원을 처리한 후에 salmonella의 histidine auxotrophs을 histidine합성 세포로 reversion되는 것을 측정한다.

박테리아는 시험하려는 물질이 있건 없건 배양한다. 왜냐하면 많은 화학물질은 mutagenic or carcinogenic활성을 나타내기 위한 동물의 효소에 의해서 활성화되기 때문이다. 그래서 화학물질은 시험되고 돌연변이 박테리아는 활성 에너지가 많은 토끼 간 추출물과 함께 배양된다. 만약에 시험될 물질이 mutagenic이라면 자연발생적인 reversion rate보다 더 빠른 속도로 His박테리아에서 His박테리아로 reversion될 것이다. 관찰된 revertants의 수는 물질이 mutagenic이고 그래서 carcinogenic일 가능성의 정도를 나타내는 지표로 사용된다.

시험방법의 종류는 많다. 일부 유해한 mutagen은 박테리아로 접종된 단일 plate위에 작은 paper disk를 놓고 그위에 화학물질을 떨어뜨려서 정성분석할 수 있다. 게다가 포도주, 혈액, 담배 응축물, 음식 추출물을 혼합시켜서 그들이 mutagen물질을 포함하고 있는지 시험할 수 있다.

Ames test에 의해 mutagenic으로 발견된 물질 중 약 90%가 동물에서 carcinogenic인 것으로 밝혀졌다. 게다가 mutagenic이 물질이 많을수록 일반적으로 carcinogenic물질이 많아지고 있다.

〈GENETIC TRANSFER AND RECOMBINATION〉

Genetic recombination은 염색체에서 새로운 조합의 유전자를 형성하기 위해서 두 DNA사이에 일어난 유전자의 교환이다. Figure8.22는 두 DNA사이에 발생한 유전자 재조합의 한 형태를 보여준다. 앞으로 편의를 위해 염색체를 A와 B로 표기할 것이다. 만약에 이러한 두 염색체가 그림에서와 같이 끊겼다가 다시 결합하면 이러한 염색체에의해서 유전자 일부가 옮겨지고 섞이게 된다. 원래의 염색체는 재조합되고 그래서 각각은 다른 유전자의 부분을 전달한다.

만약에 A와 B가 다른 개체들로부터 DNA를 대표한다면 그들이 재조합되기 위해서는 얼마나 가까이 있어야 하는걸까? 진핵생물에서 유전자 재조합은 개체의 유성 생식과정에서 발생하는 과정이다. 재조합은 일반적으로 재조합 DNA를 가진 세포가 재생산될 때 발생한다. 박테리아에서 유전자 재조합은 많은 방법으로 발생할 수 있다.

돌연변이와 같이 유전자 재조합은 진화의 다양성의 근원인 population의 유전적 다양성에 기여한다. 현존하는 미생물과 같이 고도로 진화된 개채들사이에서 재조합은 돌연변이보다 유익하다. 왜냐하면 재조합은 유전자의 기능을 덜 파괴하고 새로운 기능을 수행할 수 있는 개체의 유전자를 다시 조합하는 결과를 가져오기 때문이다.

유전물질은 여러가지 방식으로 박테리아사이에서 형질전환될 수 있다. 모든 기작은 recipient cell에 전체 DNA를 제공하는 donor cell과 연관이 있다. 한 번 형질전환되면 donor cell의 DNA의 부분은 recipient cell의 DNA로 재구성된다. 세포의 효소에 의해서 남아있는 부분은 분해된다. 자신의 DNA로 donorDNA를 구성시킨 recipient cell을 recobinant라고 한다. 박테리아사이에서 유전물질의 형질저환은 흔히 발생하지 않는다. 전체 population의 1%내지는 그이하로 발생한다.

Transformation in Bacteria

transfermation하는 동안 유전자는 용액속에서 한 박테리아에서 다른 박테리아의 'naked'DNA로 이주한다. 65년전인 그 당시에는 받아들여지지 않았지만 그 때 처음으로 증명되었다. 한박테리아에서 다른 박테리아로 이주하는 것은 유전물질이라는 것과 그물질이 DNA라는 사실이 증명되어졌다.