완충액, 동물세포배양배지 제조

세포배양
생물체의 조직으로부터 분리된 세포를 배양하는 것으로 식물에서는 캘러스 일부를 액체배양하거나 동식물의 종양 세포를 배양하는 일이 흔하다. 세포배양으로 얻은 세포군이 경우에 따라서는 1개의 개체로 생장하기도 한다.

배지: 적당량의 영양성분을 혼합해서 미생물을 생존시키고 지속적으로 증식시키기 위해서 인공적으로 증식환경이 만들어진 상태, 미생물을 생육시키기 위한 각종 영양소의 혼합물을 말한다.

cell culture에 쓰는 기본적 media

1. 기본합성배지
1> 아미노산 ; 세포의 단백합성의 원료로 성장과 생장에 이용/ 글루타민을 주로 이용
2> 비타민 ; 세포활성을 유지에 필요 / 혈청 첨가 배지는 혈청속에 포함+
3> 무기염류 ; 세포의 기능 발현 조절
4> 당류 ; glucose 이용
5> 탄산수소나트륨 ; 배지의 pH 유지
2. 혈청
1> 단백분해효소의 활성 억제
2> FBS(소태아혈청), CBS(어린 소혈청), BS(어린소혈청)
3> Serum은 사용하기 전에 inactivation 이라는 전처리
4> Serum을 56°C 에서 30분 동안 가열하여 serum 속에 존재하는 항체 및
complement를 불활성화 시키는 것
inactivation 과정 중 단백질 변성이 있을 수 있으므로 꼭 필요한 경우가 아니면 생략
3. 항생제 : 세균증식 억제

동물세포에서 사용하는 배지(DMEM)

DMEM(Dulbeco"s Modified Eagle"s Medium)는 가장 일반적으로 사용되는 animal cell culture용 media이다.

DMEM 제작
1.DMEM 가루를 DW를 넣어 액체상태로 만든다. (이 과정만 clean bench 밖에서 해야 함)

2.D.W를 넣어 만든 DMEM용액을 멸균해야 한다.
:여기서 멸균은 0.22-0.4nm pore filter를 이용하여 여과시키는 것을 말한다.
** 보통 1.2과정은 미리미리 해두어서, 멸균된 DMEM용액을 X10 또는 X5로

농축희석 상 태로 냉동 보관하다가 필요할 때 꺼내어 해동하여 사용한다.
: 예를 들면 500ml용 DMEM을 희석할 때 DW 500ml 넣지 않고 50ml 만 넣고

희석하 면 X10 상태의 DMEM 농축액이 된다.

--> 이는 여과 멸균시 작업이 용이하고, 일종의 유통 기한이 연장되는 이점이 있다.

2.용기에 X10 DMEM 100ml을 넣는다.

3.2.에 FCS 100ml을 넣는다.

4.3.에 a-biotic a-mycotic 10ml, L-glutamine 100ml을 넣는다.

5.4.에 gentamicin을 넣는다.

6.bicarbonate buffer14.7ml을 넣는다.
:이 용량은 꼭 절대적인 것은 아니다. 넣으면서 최종적으로 색깔 변화를 관찰하면서 넣어 야 한다. (상황에 따라 14.7ml 보다 더 넣어야 할 때도 있고 적게 넣어야 할 때가 있다.)

7.모두 섞이게 천천히 흔들어주고, 25 culture bottle에 5ml 정도 넣어준다.
:이는 incubator에 24시간 배양해본 후 오염여부를 test 한다.
만약 오염시 빠른 속도로 배지의 색깔이 노랗게 변하며 이는 어떤 세포의 대사가 활발하 다는 것을 의미 한다. 현미경으로 관찰시 세균 또는 곰팡이등의 미생물이 확인되며 이 배 지는 사용할 수 없게 된다.

8.액체로 나온 DMEM 상품을 사용 시엔 따로 2,5,7이외의 모든 과정은 생략 할 수 있다.

완충액(buffer)
실험중 샘플의 pH가 바뀌거나 할수가 있는데 단백질 같은 경우 pH에 민감해서 구조가 바뀔수도 있고
DNA의 경우 이중나선이 풀릴수 있기때문에 사용한다.

주로 PBS(phosphate buffer silane)가 가장 많이 사용된다.

완충액의 조제

K2HPO4 나 NA2HPO4를 사용할 때 그 시약의 분자량에 따라 만들고자 하는 몰농도에 따라 약량을 소정의 증류수에 녹인후(보통 0.01M) 염기액은 보통 알카리성을 나타내므로 일염기 즉 산성액을 서서히 부으면서 산도를 조정한다. ( 보통 pH 7.0, 0.01M)

토의

이번실험은 동물세포배지와 pbs를 제조하는 실험이었으나 조교님이 배지파우더를 안가져오신 관계로 pbs만 제조하였다. 완충액 작용을 하는 PBS(phosphate buffer silane)는 이름에서와 같이 인으로 완충작용을 하는 완충액으로 nacl과 kcl은 삼투압을 조절하고 kh2po4와 nahpo4 는 인이 들어있어 완충작용을한다. pbs제조시 처음 d.w 1리터에서 약간 덜어낸 후 시료들을 넣는데 이는 시료로 인해 1리터를 초과할 수 있기 때문에 미리 덜어 놓고 시료를 넣은 후 다시 1리터를 맞춰주는것이다. 시료를 넣을때 순서는 상관 없으나 nahpo4는 조해성이 있어 눅눅해질 수 있으므로 주의한다. pbs의 적정 ph는 7.0에서 7.4 이므로 제조가 끝난 후 ph paper로 ph를 체크하는데 ph paper 는 시간이 지나면 색깔이 변하기 떄문에 바로 확인하여야 한다.
실험은 하지 않았으나 수업시간에 배운 바로는 동물세포의 media에는 대표적으로 h-dmem(여기서 h는 high glucose를 의미한다) 과 rpmi를 사용한다. h-dmem 의 경우 대사는 느리나 크기가 큰 세포를 기를 때 사용하고 rpmi 는 대사가 빠르고 크기가 작은 세포를 기를떄 사용한다. 대부분h-dmem은 부착형세포에 사용되고 rpmi는 부유형세포에 사용되는데 절대적인 것 은 아니다. 배지의 색깔이 붉게 띄는것은 배지속에 포함된 지시약인 phenol red 의 색이 ph가 7.0 보다 크면 자줏빛을 띄고 7.0보다 작아지면 노랑색을 띄게되는데 노랑빛을띄게되면 배지를 새것으로 갈아주어야 한다. 세포가 살아가는데 필요한 것이 전부 들어있는 full media 는 antibiotics와 fbs(10%)를 포함하는데 여기에 들어가는 antibiotics는 penicillin과 streptomycin이 들어가는데 antibiotics는 eukaryote에는 무해하지만 prokaryote에는 유해하게 작용하여 bacteria만 선택적으로 죽이는 작용을 한다. fbs는 fetal bovine serum의 약자로 송아지의 혈청으로 media내에서 groth factor로 작용한다.