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대학 과제 및 리포트/세포생물학실험-생물학과

동결세포 (frozen block) 제작

by 찬재 2009. 8. 11.






병리진단에 있어서 조직의 병변과 조직내부의 단백질․당쇄의 위치, DNA․RNA의 존재 등을 알기 위해서는 세포․조직의 형태 그대로 보존한 상을 현미경으로 관찰할 필요가 있다. 이러한 경우 조직을 얇게 자른 것(수㎛의 두께)을 slide glass에 붙여, 각종 여맥․처리 등의 작업을 해야된다. 이와 같은 병리표본의 제작 방법에는 paraffin 절편 제작법과 동결절편제작법이 있어서 진단의 필요성에 따라 이들 중 어느 쪽을 선택한다해도 이점과 결점이 있고 단순하게 어느 쪽이 좋다고는 말할 수 없으나, 일반적으로는 H&E염색과 특수염색(Azan․Mallory염색, Silver impregnation 염색 등)에는 paraffin 절편이 적합하며, 지방염색(Zudan 염색)과 in situ hybridization법에는 동결절편으로 양호한 결과를 얻을 수 있다. 면역조직 화학염색으로는 사용하는 항체의 특성과 필요에 따라 그중 한 쪽을 선택한다.

■ 동결절편 표본에 대해서

동결절편 표본이라고 하는 것은 동결시킨 표본을 cryostat로 절편하여 제작한 것이다. 이 경우의 표본은 채취한 재료(장기 또는 시료)를 동결조직 포매제(OCT compound)로 감싸 동결시킨 것이며 cryostat는 -10~-40℃정도의 저온도하에서 microtome에 의한 미세 절단을 가능하게 하는 기계이다. 그럼 어째서 paraffin 절편이 아닌 cryostat를 사용하여 동결절편을 제작할 필요가 있는 것일까? 그것은 동결절편 제작의 경우에는 paraffin 절편 제작시에 필요한 유기용제와 가열 등의 처리가 없으므로 세포내의 단백질․지질․가용성 항원물질 등의 유출이나 실활 없이 신속하게 진달할 수 있고 전자현미경 수준의 위치확인도 가능하다는 등의 이유 때문이다.

【원리】

조직을 동결시키는 원리는

① 조직을 냉매(열 추출기)에 접촉시켜 열의 전도에 의해 동결시키는 방법 : 액화질소탱크(-190℃정도)

② 기화열을 이용하는 방법(액체가 기화되면서 주위의 온도를 빼앗아 감.) : CO₂gas이용.

③ Dry ice (solid carbon dioxide)를 이용하는 방법 : -70℃정도.

④ 소형식 분사식 스프레이(aerosol spray)를 사용하는 방법 : -50℃정도.

【용도 및 목적】

응급진단을 위해 수술 중 시행하는데 수술의 범위나 수술 중에 치료 방침을 결정할 수 있다. 각종 암이나 종양 등의 질환에 광범위하게 시행된다.

① 외과 수술 중 신속한 진단이 필요할 때 실시한다.

② 조직내 지질을 증명해야 할 경우에 실시한다.

③ 효소조직의 화학적 검사가 필요할 때 실시한다.

④ 형광 항체법을 실시할 경우에 필요하다.

⑤ 중추신경계 구성 성분을 염색할 때 실시한다.

⑥ 건(tendon)과 같이 파라핀 박절이 어려운 조직을 박절할 경우 동결절편 검사를 실시한다.

【장점】

① Paraffin 절편에 비해 항원성이 우수하게 유지된다.

② 지질이 유출되지 않으므로 지방염색이 가능하다.

③ 전자현미경 수준의 면역조직 화학염색의 위치관찰이 가능하다.

④ 표본제작 시간이 빠르고 신속한 진단이 가능하다.

【단점】

① 광학현미경 수준의 조직의 형태․구조 보존은 paraffin 절편에 비해 몇 단계 떨어진다.

② 시료의 보존가능기간이 비교적 짧다-80℃에서 수개월은 보존가능).

■ 동결절편 표본의 제작법

(1) 필요한 기구 및 시약

․ 동결용 포매제(OCT compound 등)

․ 동결용 액체질소, 또는 드라이아이스․에탄올(드라이아이스․아세톤)

․ 고정이 필요한 경우 : 고정액(10% formaline, 4% paraformaldehyde 등)

․ 고정이 필요한 경우 : Sucrose

․ PBS(인산 완충생리식염수)

․ 동결용 포매접시 (없으면 대신 알미늄 호일 등으로 접시를 제작해도 된다.)

․ Slide glass(saline 등의 코딩 slide가 좋다.)

․ 염색바구니(slide를 세우는데 필요)

․ Cryostat (라이커사, 브라이트사 등)

․ Dryer (냉풍건조용)

(2) Block제작

동결절편을 제작하기에 앞서 처음 고정한 기고정 동결절편으로 할 것인지 미고정 상태로 신선동결절편으로 할 것인지를 정하지 않으면 안 된다. 이는 목적으로 할 염색법과 조작에 따라 선택할 필요가 있으므로 중요하다. 동결절편에서 사용되는 일반적인 고정액은 10% formaline, 4% PFA(paraformaldehyde), Zamboni(PFA + 피클린산)액 등이다. 고정함으로써 조직내부의 세포의 구조․물질을 부동화시킨다. 이들은 항원과 RNA의 보존도에 영향을 준다. 또 고정인지 미고정인지에 따라 다음의 조작에 약간 차이가 생긴다. 신선 동결절편의 경우 동결용 포매접시에 분주한 동결용 포매제에 적출한 장기를 그대로 절단하고 싶은 면을 아래쪽으로 하여 액체 질소 또는 드라이아이스․에탄올 내에서 신속 동결시킨다. 동결시간을 가능한 한 짧게 하여 동상으로 인한 조직의 파괴를 최소한으로 줄일 필요가 있기 때문에 조직의 동결은 신속히 행해야 한다. 포매제가 하얗게 굳으면 동결은 완료되며 제작 후 block은 -80℃에서 보존한다.

다음으로 기고정 동결절편의 경우는 필요 최소한으로 잘라낸 장기를 고정액에 잠기게 한다. 10% formaline을 사용할 경우에는 4℃에서 24시간 정도(5mm 정도의 크기) 고정한다. 고정한 후는 고정액의 세정․치환조작이 필요하게 된다. 우선 10% sucrose/0.1 M PBS(4℃)에서 4시간 후, 15% sucrose/0.1 M PBS(4℃)에서 4시간 동안 잠기게 한다. 이들 작업을 하는 것으로 고정 장기는 cryostat로 cutting하기 쉬워진다. 세정작업 종료 후, 동결용 포매접시에 분주한 동결용 포매제에 침전하고 신선 동결 단편일 경우와 같이 동결․보존 작업을 실시한다. 건조되지 않도록 밀봉하여 -80℃에서 보존하면 조직은 수개월 보존가능하다.

(3) Cryostat에 의한 cutting

동결용 포매제를 사용하여 cryostat의 시료대에 동결 block을 붙인다. 시료대를 cryostat에 세트하고 microtome으로 cutting한다. 최초로 microtome의 절편의 두께를 10~20㎛으로 설정하고 cutting한다. 그 후 목적두께의 (3~10㎛)날로 바꾸어 main cutting한다. 최근 microtome의 날은 거의가 1회용이기 때문에 block에 닿게 날의 부위를 이동시키는 것만으로도 main cutting을 할 수 있다. 다음으로 cutting에 의해 종이와 같이 된 ㎛의 두께의 절편을 slide glass에 붙인다. Slide glass를 조속히 절편에 가까이 하면 절편이 slide에 붙으므로 간단하게 절편을 취할 수 있다. Slide glass에 붙인 절편은 그대로 신속하게 dryer의 냉풍으로 건조시킨다. 염색바구니에 세워서 냉풍을 쏘이면서 적어도 1시간 정도는 건조시킬 필요가 있다. 건조가 불충분하면 다음 염색작업 중에 조직이 떨어지고 만다. 이때 사용하는 slide는 silane 등의 코팅처리가 완료된 제품이 좋을 것이다. 코팅되지 않은 slide로는 염색 중에 절편이 박리될 가능성이 높기 때문이다. Cutting시의 설정온도에 대해서는 우선 -18~-20℃정도로 시도해 보는 것이 좋다. 그래도 박절하기 어려울 경우 설정온도를 -20℃부터 상하로 2℃정도씩 바꾸어 시도해 본다. 뇌와 신장의 경우는 -20℃보다 높은 온도, 유선 등의 지방조직을 많이 함유하는 조직일 경우에는 -20℃보다 낮은 온도가 좋다. 절편의 주름이 많이 생기면 온도가 너무 높은 것이고, 절편이 너덜너덜해 지면 온도가 너무 낮은 것이다. Cryostat와 포매제의 차이에 따라 적정온도는 달라지므로 다양하게 시험해보고 가장 박절하기 쉬운 온도를 찾아야 한다.

(4) 미염색 slide 표본의 보존

박절한 slide 표본은 완전히 건조시킨 후, 바로 염색조작에 사용하는 것이 바람직하다. 바로 사용하지 않을 경우는 slide glass case에 밀폐하여 -80℃에서 보존할 수 있다. 수개월은 보존 가능하지만 그다지 장기간 보존할 수는 없다. -80℃에서 보존한 slide glass를 재사용할 경우는 실온으로 되돌린 후, 완전히 건조시킨 후 사용한다. 이때 가능한 한 slide glass에 서리가 낄 정도의 급격한 온도변화는 피해야 한다.

■ 동결절편을 염색에 사용할 경우

Cryostat로 제작한 slide 절편을 염색할 경우, 신선 동결절편은 고정조작이 필요하다. 고정 하지 않으면 염색과정에서 조직의 박리․세포내 물질(항원 등)의 유출이 일어나고 만다. 이때 사용하는 고정액은 주로 10% 포르마린, 4% PFA, 아세톤, 에탄올 등으로 4℃에서 10분간 고정한다.

고정 후 포르마린계의 고정액이면 증류수로 씻어내고, 알코올계의 고정액이면 바람으로 건조시킨 후 증류수로 씻어낸다. 이 씻어내는 작업을 하는 것으로 수용성의 동결용 포매제가 떨어져나가 slide 상에는 조직절편만이 남게 된다. 기고정 동결절편일 경우는 박절․건조시킨 후 그대로 증류수로 씻어낸다.

무롤 씻어낸 후의 조작은 탈 paraffin후와 동일하게 해도 상관없다. 동결절편으로 면역조직 화학염색을 할 경우에도 최종적으로 탈수․투철 작업을 하여 영구표본으로 할 수가 있다.

■ 목적에 따른 동결절편의 제작

① 통상의 염색 (H&E stain, Azan․Mallory 염색 등)

고정액은 통상, 10% formaline을 사용하여 절편의 두께는 4~6㎛로 한다. 아세톤과 알코올계의 고정액으로 고정한 경우에는 formaline계의 고정액으로 고정을 한 조직과 비교하면 완성색조가 조금 바뀌게 된다.

② 지방염색 (Zudanduator, oil red O 염색 등)

고정액은 통상 10% formaline을 사용하며 알코올계의 고정액은 지방성분이 용출하므로 사용하지 않도록 한다. 최종적으로 탈수․투철 작업도 하지 않는다. 염색 후는 수용성 투입제로 투입한다.

③ 면역조직 화학염색(형광항체법, 효소항체법)

고정액은 4% PFA 혹은 아세톤을 사용한다. 기고정 동결절편이나 신선 동결절편 모두 우선은 4% PFA를 시도해본다. 염색작업시간이 길기 때문에 박리방지를 위해서 silane 등의 코딩 slide를 사용하는 것이 좋다.

In situ hybridization (DNA, RNA)

고정액은 4% PFA로 사용한다. 표적이 DNA일 경우는 통상과 같이 취급해도 관계없으나, 표적이 mRNA일 경우는 주의해야 한다. RNA를 취급하는 방법은 RNase free의 조건하에서 작업을 해야 한다(장갑과 마스크를 찰용하고 가능하면 RNase의 contamination을 방지할 수 있도록 한다). RNA의 경우에는 표본 제작시에 사용하는 기구류는 가능한 한 건열멸균, 혹은 DEPC로 처리한다. 시약류는 RNase free water를 사용하여 조제하며 절편의 두께는 5~10㎛면 된다. 염색 작업시간이 길기 때문에 박리방지를 위해서 코딩 slide를 사용하는 것이 좋다.

⑤ LCM (Leather ․ Capture ․ Microdisection)

세포를 보충할 필요가 있으므로 코팅하지 않은 slide를 사용해야 한다(코팅 slide로는 접착력이 너무 강하여 세포를 채취할 수 없다). 신선 동결절편을 코팅하지 않은 slide에 붙여서 LCM을 하면 양호한 결과를 얻을 수 있다. 또 박절․부착후의 강제건조는 절대로 피해야 한다. 절편의 두께는 8㎛정도가 좋다. 4㎛이하의 초박절편은 세포 내용물(mRNA)이 유출된다.

■ 동결절편 검사 시 주의사항

1. 동결절편 검사는 병리과의 업무 중 가장 중요하고 어려운 것 중의 하나임.

2. 동결절편 검사를 효과적으로 수학해가 위해서 필요한 사항

- 환자의 정확한 임상병력

- 이전에 시행한 병리검사의 결과

- 수술소견

3. 외부에서 이송된 환자의 경우 반드시 수술 전에 병리 슬라이드와 병리보고서를 재검토하여야 함.

 

 

※ 참고문헌e

- 《조직검사학》전국임상병리교수협의회 조직․세포분과위원회 편, 고려의학, 1992

- 《조직검사실습》전국임상병리교수협의회 조직․세포분과위원회 편, 고려의학, 1993

- 《면역조직화학기법》장촌의지․명창굉 외 8명, 범문사, 2004

- www.mizmedi.com/staff/anatomic_activity.asp

- aquamed.pknu.ac.kr/study/study04.asp

- http://kimjinwoo.tistory.com/entry

- http://www.takara.co.kr/pds/magazine/pdf/23/h_1.pdf

- http://kumi.chamc.co.kr/CHA/medical/main.asp?p_code=AP&index=1348