ELISA

1.실험 제목 : ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY(ELISA)이다

2.실험 목적 : ELISA를 직접 실험해보고 ELISA에 대해 알아보자.

3.이론

(1) 혈청학적 일반적 지식

①항원 (Antigen)

이종 동물체내에 들어갔을 때 그와 특이하게 반응하는 물질(항체)을 생산하게 하는것으로서 근래에는 면역원(immunogen)이라고도 함. 즉 항체를 만들 수 있는 항원성(antigenicity)과 형성된 항체와 반응하는 반응특이성(specific reactivity)을 가짐을 특징으로 함.

② 항체 (Antibody)

항원(외부에서 온 물질)을 파괴하기 위해 특별한 림프구가 만들어 내는 단백질. 주로 세균, 바이러스,기타 미생물이 여러 가지 항원을 함유한다. 항원 자극후 생성되는 면역글로불린(Ig)으로 항원과 특이적으로 반응함.

③ 단클론 항체 (Monoclonal Antibody)

단일 항원결정기(antigenic determinant)나 에피토프(epitope)에 대한 아주 균일한 항체로서 교잡기법(hybridoma technique)에 의한 한 세포군에서 지속적으로 만들 수 있음.

④ 혈청 (Serum)

체액의 맑은 부위. 혈청은 혈액을 응고시켜 분리한 맑은 액체

⑤효소 (Enzyme)

세포의 활성과 기능을 조절하는 단백질의 한 형태.

⑥ 효소결합 면역흡착 분석법 (ELISA)

ELISA(enzyme-linked immunoabsorbent assay)는 혈청 중의 HIV-특이 항체를 감지하는 시험이다. ELISA는 표준적인 HIV 검사로 간주되고 있다.

⑦ 후천성면역결핍증 (AIDS, acquired immunodeficiency syndrome)

인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV)에 의한 면역기능 손실로 각종감염증 및 악성종양 등이 발병하여 사망에 이르는 병. 지금까지 에이즈에 대한 치료방법이나 백신은 없지만, 증상과 합병증은 여러 가지 치료에 대하여 다양하게 반응한다

2. ELISA의 원리

응집반응이나 침전반응(6. 항원-항체 반응을 이용한 다른 분석법 참조)과 같은 항원-항체 반응은 매우 빠르고 쉽게 실험할 수 있는 우수한 방법이지만 민감도가 떨어진다는 한계가 있다 하지만 항체(혹은 항원)에 동위원소나 형광물질 혹은 효소 등을 붙여 항원-항체 반응의 민감도를 높일 수 있으므로 극소량(picogram)의 항원이나 항체도 검출할 수 있다. ELISA는 항체에 효소를 결합시켜 항원-항체 반응을 확인하는 방법으로, 그 방법이 간단하고 비용이 많이 들지 않으며 다량 분석이 가능하여 현재 가장 널리 쓰이고 있는 항원-항체 분석법의 하나가 되고 있다. 특히 이 방법은 방사능면역시헙법 (RIA, Radio ImmunoAssay)고 같이 매우 민감한 반응이면서도 RIA에서처럼 방사능을 사용하지 않는다는 잇점이 있어서 그 사용이 증가되고 있는 방법이다.

항체에 결합되는 효소 중에는 간단한 기질 용액을 넣어주면 색깔을 띄는 반응이 이용되는 데, 대표적인 효소로는 염기성인산분해효소 (alkaline phosphatase)나 양고추냉이과산화효소 (HRP, horseradish peroxidase) 등이 많이 이용되고 있다. 이들 효소는 항체분자의 C 지역에 공유결합되도록 화학반응을 이용하여 결합시키며, 일반적으로 isotype에 대한 항체에 효소가 결합된 형태 (enzyme conjugated anti-isotype antibody, 예를 들어 alkaline phosphatase conjugated anti-mouse IgG 등등)로 판매되고 있으며, 자신이 이용하는 항체의 급에 맞는 효소결합항체를 구입하여 사용하면 된다.

ELISA 방법은 단백질 항원을 플라스틱 microtiter plate에 흡착시킨 다음 항혈청과 반응시키고 세척한 후 효소가 부착된 항 글로블린을 첨가한다. 그 후 효소에 대한 기질을 처리하여 발색되는 정도를 분광광도계를 이용하여 항원-항체반응을 측정한다. 이 과정을 자세히 말하면 다음과 같다

1) 어떤 plastic surface에 대해서 흡착성이 있는 protein에대해서, 그 ptrotein을 buffer와 함께 그 plastic plate에 넣고 room temperature에서 한동안 incubation하면 protein의 흡착성에 의해서 이 protein은 plastic surface에 접착한다. 이것을 이용하여 특정 antigen을 plate바닥에 흡착시킨다.

2) 남은 enyme과 buffer가 버려진 다음, enzyme과 화학적으로 결합한 antibody와 과량의 protein이 섞인 buffer를 plate에 넣어서 antigen-antibody reaction을 일으킨다. 이때, 이 protein은, antibody가 antibody와 antigen사이의 반응에 무관한 것이어야 하며, antibody가 antigen대신에 plastic과 반응하는 것을 막아준다.

3) 다시 buffer를 부어내고, 특정한enzyme에 대한 기질중에서, 염색 물질을 가지고 있는 것으로, enzyme과 반응하지 않으면 그 색을 들어내지 않는 것들을 plate에 넣는다.

결론적으로 plate표면에는 antigen이 결합해 있으며, 각 antigen에 특정한 antibody를 결합시키고, 이 각각 의 antibody에는 특정한 enzyme이 결합해 있다. 그 enzyme에 반응해야만 색깔을 나타내는 기질이 enzyme에 결합함으로서 어떤 antigen이 어디에 어떻게 존재하는지 색깔로 나타난다.

3. monoclonal antibodies를 이용한 ELISA외 다른 실험 법을 알아보았다.

①Western blot

단클론 항체가 인지하는 항원을 알고 있을 경우, 혹은 mouse 를 immunize한 세포의 lysate를 SDS-PAGE의 기법으로 크기에 따라 분리하고 nitrocellulose membrane 으로 transfer한 후 membrane에 단클론 항체를 반응시키고 세척후 peroxidase conjugated anti-mouse immunoglobulin을 반응시키고, 다시 세척 후 기질로서 DAB(diamino-benzidine)이나 ECL(enhanced chemiluminessence)을 반응시켜 발색반응을 보거나 x-ray flim에 감광시켜서특이반응을알아본다..

②immunoprecipitation

단백질 특이 항체를 이용하여 특이 단백을 면역침전의 과정으로 정량적으로 분리할 수가 있다. 특이 항체를 cell extract에 첨가하는데 침전물을 용액으로 부터 확인하기 위해 화학적으로 고정된 Staphylococcus aureus bacteria를 첨가한다. 이 bacteria는 protein A를 통해 항체와 complex를 형성한다. bacterial protein의 특징은 immunoglobulin의 Fc 부위에 high affinity를 지닌다. 이와 다르게 변형된 방법으로는 정제된 protein A 를 sepharose bead에 부착시키서 항원-항체 복합체를 cell extract로 부터 분리한 후 pellet을 잘 수세한 후 원하는 결과물을 얻는다.

③ Immunohistochemistry

면역조직화학은 조직내의 항원이나 항체를 면역반응을 이용해 검출해내는 방법으로 항원 항체의 면역반응
을 가시화하여 확인하는 기법이다. 확립한 단클론항체가 조직에서 나타내는 반응성을 찾기위하여 사용된다.

EX) PAP 법은 peroxidase에 대한 항체를 만들고, 이 항체와 peroxidase 를 면역학적으로 결합시켜 형성된 면역복합체인 PAP(peroxidase anti-peroxidase)를 사용하는 방법이다.PAP 볍은 하나의 항원-항체 반응물에 3개의 peroxidase가 결합되어 강도가 높다. 여기에 avidin 또는 streptavidin 과 biotin의 강한 결합력을 이용한 ABC법은 2차 항체에 biotin이 결합되어 있고, 여기에 peroxidase가 부착된 streptavidin 을 3차로 부착시켜
signal을 증폭시겼다.

④ Immunofluorescence study

EX)IF microscopy

특이항체를 반응시켜 형광현미경으로 세포나 조직의 구조를 육안으로 확인 하며 세포의 항원과 반응성을 세포나 조직절편에서 항체와 부착된 물질을 확인하는데 매우 유용한 방법중 하나며, 형광 현미경을 민감도로 육안으로 측정할 수 있다. 형광염색제를 특이 항체에 직접 부착하여 염색에 사용하거나 결합된 항체에 형광이 부착된 2차 항체를 염색하여 검색하기도 한다. 일반적으로 indirect immunofluorescence로 잘 알려져 있다.

5.실험 결과

 

	1	2	3	평균값
PBS	0.062	0.064	0.065	0.064
anti-CD3	0.089	0.072	0.087	0.083
3e1	0.071	0.082	0.063	0.072
anti-CD3 + 3e1	0.090	0.083	0.095	0.089

 

6.토론

이번실험은 elisa 로 enzyme-linked immunosorbent assay의 약자 즉 효소면역흡착 분석법으로 항원-항체 반응을 이용하여 효소에 대한 기질을 처리하여 발색되는 정도를 분광광도계를 이용하여 알아보는실험 이다
elisa 에는 단백질의 항원 항체 반응이 대부분의 단백질에 반응하는것을 이용해서 단백질의 유무를 검출하는 indirect elisa 와 1,2차 항원 항체반응을 통해 특정 단백질의 발현을 관찰할때 사용하는 sandwich elisa, 항체에 대한 항원을 경쟁적으로 처리해서 일정한 항체만 항원에 달라붙게 만드는 competitive elisa 가 있는데 우리가 사용한 방법은 sandwich elisa 이다. 우리가 사용한 blocking 용액은 bsa였고, 발색기질은 tmb를 사용하였다.항원그룹은 4그룹으로 나누었는데 대조군으로 pbc를 사용하고 anticd3, 3e1, anticd3+3e1으로 나누어 실험했다.
elisa 실험에서 각 step 마다 pbs,bsa,계면활성제 역할을 하는 tween20 로 washing을 해서 고정된 부분에 항원이 붙지않도록 해야 정확한 실험결과를 볼 수 있다.
실험목적은 항원에 대해 항체의 생성을 유도하는 물질인 cytokine의 양을 알아보는 것이었는데 anti-cd3 + 3e1에서 가장 높은 결과가 나온걸로보아 anti-cd3 + 3e1 에서 항원-항체반응이 가장 왕성하게 일어났음을 확인할 수 있었다.

7.reference

①http://home.inje.ac.kr/~lecture/immunollab/02immlab02immunization.hwp

lehninger

② 생화학 4판 principle of biochemistry

3. 생명과학과 생명공학 409p