동물세포배양 - MTT 측정

mtt assay
mtt assay 는 미토콘드리아의 활성을 측정하는 실험으로 세포의 증식 또는 살아있는 세포를 정확하게 측정할 수 있는 실험이다. 현재 많이 사용되고 있는 Tetrazolium-based colorimetric (MTT) 검색법은 96-well plate를 사용하고 검사결과를 ELISA reader를 이용하여 많은 시료를 간단히 빠르고 객관성 높게 판독할 수 있어 세포독성 및 세포증식 검색법으로서 sulforhodamin B (SRB) 검색법과 더불어 널리 사용되고 있다.MTT 검사법은 항암제의 감수성에 대한 1차 선별검사의 목적으로 많이 사용되지만, 성장인자에 대한 세포의 감수성 실험 등에도 대단히 유용하게 사용될 수 있다.

mtt의 원리
MTT assay는 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT formazan (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법이다. MTT formazan의 흡광도는 540nm의 파장에서 최대가 되며, 이 파장에서 측정된 흡광도는 살아있고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다. 그러나 측정할 well의 세포의 농도가 너무 낮거나 높은 범위에 있으면 살아있는 세포의 농도와 흡광도 사이의 직선적인 비례관계가 성립되지 않게 되므로 최적의 세포농도를 결정하는 과정을 거쳐야 한다.

MTT assay

1. cell suspension을 haemacytometer를 사용하여 counting한 다음, 96 well plate의 각 well에 원하는 적정농도의 cell 부유액 180ul를 넣는다.
- Blank ; 배지 180ul와 PBS 20ul.
- Control ; 세포부유액 180ul와 PBS 20ul

2. 측정하고자 하는 시료는 PBS에 녹인 후 농도별로 20ul씩 각 well에 첨가한다.

3. 원하는 시간만큼 incubation한다.

4. 시료를 제거하고, 각 well에 MTT solution을 100ul씩 첨가한다.

5. 4시간동안 incubation시킨 후 MTT 희석액을 조심스럽게 제거한다.

6. 각 well에 100ul의 DMSO를 첨가하여 15-20분간 plate shaker로 흔들어 준다.

7. ELISA reader를 사용하여 wave length 540nm에서 흡광도를 측정한다.

(이 흡광도는 MTT가 세포의 의해 환원된 양을 나타내며 각 well에 존재하는 생존 세포수와 비례한다.)

 

토의.

실험진행을 모두 조교님혼자서 했는데 실험완전 망함 알콜 70% 넣은게 흡광도 제일 높게 나오고....이게 뭐임... 토의 그딴거 없다 이번 실험은 다시해야됨 이래서 조교를 잘 만나야되는거임...