mouse 로부터 면역세포의 분리 및 cell counting

면역세포

항체를 만드는 세포로서 t 세포와 b 세포가 있다. b 세포는 혈액속을 흐르는 항체인 면역글로불린을 만들고 , tㅅ포는 세포와 강하게 결합한 세포성항체를 만든다.

 

항체

체내에 이물질이 들어왔을때 이를 제거하기 위해 만들어지는 물질

감마 글로불린이라는 단백질로 구성

항원의 활동을 억제

항원- 항체 덩어리를 만들어 백혈구의 식균작용을 돕는다 (항원-항체반응)

항체는 그것을 만들게 한 항원하고만 결합하는 특성이 있다.

 

항원

항체를 만들어나는 물질

 

t세포

골수(bone marrow) 의 간세포와 흉선의 상피세포에서 특수한 내부환경과 흉선의 액성인자에 의해 림프구로 분화하는 경우 흉선(thymus)에서 유래하는 림프구, 즉 t 세포라 한다. t세포는 흉선에서 세가지 종류의 t 세포로 나뉘는 데 killer t 세포, helper t세포,  regulatory t 세포가 그것이다. 외부에 세균과 같은 항원이 들어왔을 때 helper t 세포가 cytokine과 같은 특정물질을 분비하여 killer t 세포와 b세포의 활성을 증대하면 killer t 세포는 병원체에 감염된 세포들을 죽이게 되며, b 세포는 항체를 분비하여 항원의 활성을 저해한다. 이 때 reguratory t 세포는 면역활동을 적절히 조절하는것으로 알려져 있다. b세포는 황체글로불린의 생성에 관여하고, t세포는 면역에서의 기억능력 및 항원에 오염된 세포를 파괴하는 능력을 가지며, b세포에 정보를 제공하여 항체생성을 돕기도 한다. t세포는 림프절 방피질부와 지라의 중심동맥 주위에 분포하는데, 이 부위를 흉선의존영력 이라고 한다.

 

b세포

b세포는 림프구 중 항체를 생산하는 세포이다. 면역반응에서 외부로부터 침입하는 항원에 대항하여 항체를 만들어 낸다. 사람을 포함한 포유류의 경우 bone marrow 에서 유래되므로 bone marrow의 첫글자를 따 b 세포라 부른다.

b세포는 성숙과정에서 유전자 재배열을 일으키며 이를 통해 항원에 반응 할 수 있는 매우 다양한 형태의 항체를 만들어 낼 수있는 능력을 갖추게 된다. 성숙 b 세포는 주로 림프저로가 같은 말초림프기관에 머물게 되는데, 이곳에서 일부 b세포는 외부 항원을 인식해 활성화 된다. 활성화된 b 세포는 스스로 증식하게 되어 겨로가적으로 항원 특이적인 b 세포의 비율이 높아진다. 이후 b 세포는 항원에 특이적으로 장기간 기억하며 살아가는 기억 b세포로 분화한다.

 

면역 글로불린

혈청성분중 면역에 중요한 역할을 하고 또 항체작용을 하는 단백질의 총칭

 

cell counting

hemacytometer 사용법

농도계산은 커버슬라이드 아래부분의 부피에서 기본이 된다. 하나의 큰 사각형의 부피는 0.0001ml 이다. (길이 x 넓이 x 높이: 0.1x0.1x0.01cm) 살아있거나 죽은 것을 결정하기 위해 같은 부피의 0.4% tyrypan blue in pbs 를 섞거나 10% 포르말린으로 세포를 죽인 후 trypan blue 로 염색한다

 

a방법

바깥쪽 사각형 4개에 있는 세포수를 센다. 세포농도는 1ml당 세포농도= 사각형 내의 세포수x2500x희석계수

 

b방법

중앙사각형내에 있는 사각형 5개를 셈으로서 세포농도를 계산한다

5개의 사각형내의 총세포수x50000x희석계수

 

면역세포 분리라길래 면역세포찾아갔는데 면역세포분리 에 대해 찾았어야 했을듯...

 

결과

108 x 5 x 10^4 = 5.4 x 10^6 개

 

cell counting

토의

이번실험은 mouse 로부터의 면역세포 분리, cell counting 이었다.
mouse 중 주로 사용하는 종류로는 검은쥐인 c57, 흰쥐인 balb/c, 털이없는쥐인 nude 가 있는데 우리는 비교적 흰빛을 띄는 림프절을 구별하기 쉽도록 검은쥐인 c57을 사용하였다.
면역세포에는 1차면역세포(bone marrow, thymus(중앙림프계)와 2차면역세포(spleen, lymph node(말초림프계)로 나뉘는데 이번에 분리한 세포는 2차면역세포로 주로 사지에 쌍으로 위치해 있는데, lymph node 는 면역을 담당하는 면역 세포로 외부의 항원반응을 해야하기때문에 혈관이 나뉘어지는 곳인 사지에 위치하여 항원이 심장으로 들어가 온몸으로 퍼지는것을 막는다.
이번에 분리한 면역세포로는 겨드랑이 아랫부분의 axilary node, 팔근육 뒷쪽에 위치한 brachial node, 무릎 뒤쪽 오금에 위치한 poplitea, 장과 장사이의 mesentaric node, 왼쪽 신장 근처에 위치한 spleen, 샅고랑에 위치한 inguinal node 를 적출하여 cell counting 하였다. inguinal node는 비교적 구분하기 쉬웠으나 brachial node 와 mesentaric node 는 찾아내기가 어려웠고, 지방에 싸여있어 구분하기 어려웠다. 지방에 싸인 경우 핀셋으로 눌러보았을때 흐믈흐믈하게 눌려지는것이 지방이고 탱탱한것이 림프로 구분하는 방법이 있다. spleen 의 경우 적혈구가 많아 검붉은 색으로 구별하기 쉬웠다. 가장크고 많은 수의 림프를 가진 것은 mesentaric node 인데 입과 항문은 연결되어있어 항상 외부물질이 이동하기 때문에 장근처에 위치한 mesentaric node 는 민감해야하기때문에 가장 크고 많은 수로 존재한다. 적출해낸 lymph node 의 갯수를 세기 위해 cell counting 을 하는데, cell counting은 hemacytometer의 25칸 중 5개 칸의 세포를 세어 x5를 한 후(가로x세로x높이 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm=0.0001cm^3 ml로 단위환산하여 10^4)x10^4 한것을 세포갯수로 한다. UV microscope로 관찰했을때는 세포를 명확하게 구분하여 셀 수 있었는데, optical microscope 로 관찰할때는 세포를 구분하기도 어려웠다. cell counting은 1ml당 세포갯수를 세는 것으로 pbs의 양이 적을수록 세포가 많이 관찰되기때문에 실험할때 pbs의 양을 일정하게 정해두고 했어야 조별로 얻어낸 lymph node 의 양을 정확히 비교할수 있을것이다.