animal cell culture, fish cell culture

Introduction

조직배양은 유기체로부터 분리한 세포나 조직의 배양으로 배양배지에서 조직을 살아있고 성장가능하게 만드는 기술이다.

진핵세포는 대부분의 원핵생물들에 비해 배양하기가어렵다. 복잡한 media를 요구하고, 박테리아, 효모 및곰팡이와 같은 미생물에 의해 오염되기 쉽다. cell culture 에 쓰이는 기본적 media에는 아미노산,비타민,무기염류,당류,탄산수소나트륨이 들어간 기본합성배지에 FBS와 같은 혈청, 세균증식억제를 위한 항생제가 들어간다. DMEM(Dulbeco"s Modified Eagle"s Medium)은 가장 일반적으로 사용되는 animal cell culture용 media이다. 진핵세포 배양에는 세종류가 있는데 Primary cells,  Secondary cells, Immortalized cells 이다. 그중에서 우리가 실험에 사용할 세포는 293 EBNA와 HeLa이다. 293 EBNA는 인간 배아의 신장세포에서 파생된 세포이고, HeLa는 자궁경부암으로 사망한 Henrietta Lacks의 human papillomavirus 18 (HPV18)에 의한 자궁 경부암 세포에서 파생된 가장 오래되고 가장 널리 사용되는 인간 immortal cell line이다. HeLa cell culture 에는 Media (DMEM or RPM1) supplemented with 10% fetal calf serum, antibiotics (penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 microgram/ml), 5% CO2 + 95% atmosphere at 37 degrees의 환경이 필요하다.

어류 세포는 포유류나 조류의 세포와는 달리 최소한의 관리가 필요하고, 유연한 배양스케쥴, 광범위의 배양온도에서 배양이 가능하다.
이런 독특한 특성은 생물학적 실험에 사용하는데 아주 유용하다. 어류세포의 배양에는 Eagle's Minimum Essential Medium (MEM), Leibowitz Medium L-15, 또는 Medium 199, 10% fetal bovine serum이 포함된 배지가 배양하는데에 주로 쓰인다. 또는 포유류 medium도 사용될 수 있다. 어류세포는 CO2 인큐베이터를 사용하지 않고도 배양이 가능하다.
또 어류 세포는 bicarbonate-buffered medium에서의 closed culture에서도 자라고, HEPES나 다른 유기 버퍼를 사용한 정상적 환경에서도 증식 할 수있다.
냉수성 어류의 배양온도는 4~24 °C , 최적온도는 15-21 °C이고, 온수성 어류의 배양온도는 15-37 °C, 최적온도는 25-35 °C이다.
Laminar flow hoods와biological safety cabinets은 무균배양을 위해 필요하다. 세포 배양은 언제든지 위험에 노출 될 수 있으므로 외부 오염을 막는것이 가장 중요하다.
우리가 사용할 어류 세포는 CHSE 214로 연어 배아 세포이고, 주로 MEM (EBSS) + 10% FBS; Freezing medium에선 Culture medium + 10% DMSO; 25C, 5% CO2 Passage: 383, mycoplasma negative 에서 배양한다.


Method

오래된 media suction
trypsin 처리 (2ml)
새로운 media(MEM) 10ml, 오래된 media 5ml 넣는다
trypsin 제거
incubation

Discussion

이번 실험은 fish cell culture 이다. 사용한 세포는 epc cell 로 Fathead Minnow cell line 이다. 배양에 사용되는 fish cell에는 epc 이외에도 연어 배아 세포인 CHSE 214 , 무지개송어의 gonad 세포인 RTG-2가 있다.
fish cell 의 배양온도는 anmal cell의 배양온도인 37도에 비해 낮은 17.3도씨 에서 배양하고, anmal cell 과는 달리 co2 인큐베이터 없이 배양한다. 또한 새로운 배지로 옮겨주는 주기도 동물세포에 비해 길다.세포를 새로운 배지로 배양함으로 세포의 수를 증식시킬 수있는데, 배양과정에서의 trypsin 처리는 세포들을 바닥에서 떨어뜨려 새로운 배지로 옮길 수 있게 하기 위함이다. 따라서 새로운 배지로 옮긴 이후에는 trypsin을제거해야 한다. fish cell 과 animal cell 의 배양배지는 MEM을 사용하는데, animal cell에서는 PBS buffer를 사용하지만 fish cell 의 MEM 은 EBSS가 처리된 MEM 을 사용한다. EBSS(Earle`s balanced salt solution)는 세포들의 생리적인 상태인 pH7.2 로 유지시키기 위한 balanced salt를 이용한 buffer이다.

References

fish cell culture : A protocol for quality control / C.N.Lannan / journal of tissue culture methods 16 95~98 1994

http://hubpages.com/hub/hela-cell-culture