Transfection

Transfection

DNA를 culture 중인 cell 내로 유입시켜 외부 DNA가 세포 내에서 발현되도록 하는 것이 transfection의 목적이다. DNA는 negative charge를 띄는 분자이고 cell membrane 또한 negative charge를 띈다. 따라서 DNA를 cell 속으로, 더구나 핵 속으로 까지 유입 시키는 것은 여러 가지 특별한 agent를 사용한다, 높은 tranfection efficiency를 얻는 것이 모든 실험의 관건이다.

DNA를 cell 내로 유입 시키는 방법은 크게 chemical method, physical method, virus mediated method 등 3가지로 분류할 수 있다. Chemical method 에는 calcium-phosphate, DEAE-dextran, Lipofectin등의 cationic liposome 등이 DNA를 packaging하는 agent 로 사용된다. Physical method로는 electroporation, gene gun 등이 이용되며, 그밖에 virus-mediated method로서 adenovirus나 retrovirus의 virus genome에 원하는 DNA를 cloning 삽입하여 세포에 감염시키는 방법도 많이 사용되고 있다. 각각의 방법은 저마다의 장점과 단점이 있으므로 실험목적과 잘 맞는 방법을 선택하여야 할 것이다.

실험방법

* 실험재료
10cm dish에 배양한 NIH3T3 cell
DMEM(10% FCS, antibiotics 함유)
Phosphate Buffered Saline
1x Trypsin-EDTA
Serum free medium(serum과 antibiotics가 첨가되지 않은 DMEM) 또는 opti-MEM
6 well plate
0.4% tryphan blue solution
hemocytometer
cover glass
cell counter
Lipofectamin plus^TM(BRL)
DNA
Transfection에 사용할 DNA는 CsCl 법이나 이에 상응하는 방법으로 분리한 ultra pure한 상태이어야 한다. Qiagen의 midi column을 사용하면 간편하게 0.1 mg 이상의 pure DNA를 얻을 수 있다.

Transfection

여기에서는 chemical method의 한 가지인 cationic liposome을 이용한 방법을 설명하고자 한다. BRL사 에서 Lipofectamin plus 라는 상품명으로 판매하는 transfection reagent는 적은 양의 DNA로도 높은 transfection efficiency를 얻을 수 있는 장점이 있으나 매우 고가의 시약이다. 본 설명의 DNA 양 및 시약 사용량은 직경 35 mm well (6 well plate) 에 실험할 경우이므로 다른 scale 의 plate를 사용할 경우에는 해당하는 scale에 맞게 조정해야 한다.

1. PBS, serum 및 antibiotics 가 첨가되지 않은 medium을 30분 전에 37°C water bath에 담가놓는다.

2. Clean bench 내에서 멸균된 eppendorf tube에 DNA를 혼합한다. (6 well 기준, 1 well 당 1 μg 정도)

3. Serum free medium 또는 Opti-MEM 100 μl 와 Plus reagent 4 μl를 혼합하여 이를 DNA와 잘 혼합한다(pipette 사용). 15분간 상온에서 incubation 한다.

4. Serum free medium 또는 Opti MEM 100 μl에 Lipofectamin을 2 μl 가하고 이를 3과 혼합한 다음 15분간 상온에서 incubation 한다.

5. Incubation 하는 동안, 6 well plate를 PBS (1 ml/well) 2번 세척한다.

6. Serum free medium을 well 당 0.8 ml 씩 가한다.

7. 4의 DNA mix를 6의 well 에 넣고 plate를 가볍게 흔들어 골고루 섞이게 한다.

8. CO₂ incubator에서 3시간 incubation한 후 serum 및 antibiotic이 포함 되어있는 complete medium으로 갈아주고 다시 CO₂ incubator에서 배양한다.

http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_workshop/cell_culture.php

100파이 dish
 pipet
H1N1-NP
turbofect 8ul

e-tube에 opti-mem 1ml 넣음
H1N1-NP 3.5ul 넣음
turbofect 8ul 넣음
incubation 20min
petrydish에 293-EBNA에 e-tube에 넣었던 것들 듬성듬성 넣음
잘 섞은 후 incubation 48h

이번실험은 transfection 으로 DNA를 culture 중인 cell 내로 유입시켜 외부 DNA가 세포 내에서 발현되도록 하는 실험이다.
DNA와 cell membrane 은 (-) charge 를 띄고 있어 DNA를 cell membrane 안의 핵으로 보내는데는  chemical method, physical method, virus mediated method 를 사용한다. chemical method 는 reagent를 사용하여 DNA를 (+) charge로 감싸 cell membrane을 잘 통과시켜주게 하고, physical method 는  electroporation 으로 cell membrane 을 약하게 만들어 DNA가 들어갈 수 있게 하는방법이고, virus mediated method 는 virus에 원하는 DNA를 넣어 숙주를 감염시키는 방식으로 transfection 하게 되는데 우리는 a형 돼지 influenza virus 인 H1N1-NP 를 사용하여 transfection 하였다.
100파이 dish 에 DNA 최적량 8ug~10~ug
reagent dna 1:2 가 최적 이번실험에서는 1:1