Plaque assay

실험 대상 및 보관용 바이러스 부유액 내의 총 바이러스입자 수나 감염성이 있는 바이러스입자(infectiousunit)의 농도를 정확하게 알아내는 것, 즉 바이러스 titer의 측정은 바이러스의 중화시험, 항바이러스제에 대한 감수성검사, 바이러스정제 시의 순수성 평가, 바이러스의 병인성 평가 시에도 가장 기본적이며 필수적인 실험이다. 바이러스 titer 의 측정 시 실험대상 바이러스용액을 배수 희석하여 세포단층, chick embryo, 또는 동물에 접종하여 바이러스 증식 여부를 관찰하게 되며 이러한 방법은 바이러스의 감염능을 측정하는 것이다. 바이러스 감염에 대한 host의 반응은 정량적으로 측정될 수도 있고, 또는 감염의 유, 무로 판단하는 all-or-none 방법으로 판단할 수 도 있 다 . 정량적인 측정법에는 plaques assay, fluorescent foci assay (FFA), infectious centers assay, transformation assay, 또는 pock assay 등이 있다. Cytopathic effect (CPE)를 나타내는 바이러스의 정량에는 plaque assay가 가장 널리 쓰인다.

감염능 측정법 (Infectivity assays)

바이러스의 가장 큰 특징은 세포 내에서 증식하는 것이며, 바이러스에 감염된 세포는 일련의 생화학적인, 형태적인 변화를 거쳐 대개의 경우 죽게 된다. 바이러스에 감염된 세포에 나타나는 형태적인 변화를 cytopathic effect (CPE)라 하며 cell rounding, 세포융합(cell fusion; syncytia formation), 세포 용해 (cell lysis) 등의 형태로 나타난다.

Plaque assay

1952년 Renato Dulbecco는 plaque assay를 응용하여 bacterial virus stock의 titer를 측정하는 방법을 최초로
개발하였다. Plaque란 바이러스감염에 의하여 세포변성을 일으킨 단층세포부위로서, plaque 주위의 감염되지 않은 정상세포는 vital dye로 염색되므로 구별된다. 각 세균마다 특징적인 colony가 만들어지듯이 각바이러스마다 크기와 모양이 다른 특징적인 plaque가생성된다. 한 개의 감염성이 있는 바이러스입자는 하나의 plaque를 형성한다는 이론 하에 plaque counting은
각종 바이러스의 정량에 응용되었으며, Dulbecco는 1975년 노벨 생리학상을 받음으로서 plaque assay의 중
요성이 입증되기도 하였다. 그러나 plaque assay는 CPE를 나타내는 바이러스의 정량에만 사용될 수 있다.
세포단층을 준비한 다음, 정량 하고자 하는 바이러스 부유액을 10^-1에서 10^-6까지 10배수 희석시킨다. 희석액을 0.1mL 내지 0.5mL씩 접종시킨다. 1-2 시간 정도 바이러스를 흡착시킨 후 overlay media를 가한다. Overlay media는 영양을 공급함과 동시에, 최초의 감염세포에서 증식된 바이러스가 배지를 통하여 퍼져나가 주위 세포를 이차 감염시키는 것을 방지하는 역할을
하도록 gel 상태가 되도록 배지를 만든다. Plaque는 바이러스에 감염되지 않은 주위의 건강한 세포단층과 대조되어 무색의 뚜렷한 foci로 나타난다. Plaque counting 을 보다 용이하게 하기 위해서 neutral red나 crystal violet 같은 vital dye로 세포단층을 염색하기도 한다. 건강한 세포는 dye를 흡수하여 염색이 되고, 감염된 세포 즉 plaque 부위는 염색되지 않고 무색으로 남아 있게 된다. Plaque 수를 세고 접종량과 희석배수를 감안하여 바이러스 stock의 titer는 plaque forming units per
milliliter (PFU/mL)로 나타낸다.계산시의 오류를 최소화하기 위하여 여러 희석 배수를 사용하며, plaque가 20-100개정도 형성되는 plate로 count하여 titer를 계산한다. Plaque수×희석배수×mL로 환산한 접종량 = ( )PFU/mL

예) 10^-6 희석액 0.1mL에서 50개의 plaque가 관찰되었다면, stock 용액내의 바이러스 역가는 50×10^6×10 = 5×10^8 PFU/mL

이렇게 바이러스 titer가 측정되면, 핵산증폭검사의 민감도를 측정하기 위하여, 일정량의 용액(핵산 추출을 위하여 일반적으로 처리하는 검체량) 속에 2, 4 , 8, 16, 32, 64 PFU 또는 1, 10, 100, 1000 PFU가 포함되도록 바이러스 stock 용액을 적절하게 희석하여 새로이 도입되는 핵산증폭검사의 민감도를 측정할 수 있으며, 또한 원하는 농도의 양성대조군을 만들 수도 있다.

바이러스 입자수 측정

바이러스입자수의 측정은 전자현미경과 표준입자(크기와 농도를 알고 있는 polystyrene latex particles)를 이용하여 이루어진다. 먼저 전자현미경용 grid를 plastic film (0.1-0.5% Formvar 또는 0.5-1.5% collodion)으로 coating한 후 다시 carbon-coating, ion-coating을 시행한다. 표준입자용액을 희석하여 108particles/mL 농도가되도록 한다. Latex particle 용액과 측정하고자 하는 바이러스용액을 동량 섞고, negative stain 용액(1-3%phosphotungstate 또는 1-2% uranyl acetate)도 동량 섞어
서 coated grid에 접종한다. Grid를 공기 중에서 건조시킨 후 전자현미경으로 관찰한다. Negative stain을 하면 바이러스의 특징적인 구조가 관찰되어 표준입자와 구별이 되므로 전자현미경 하에서 표준입자와 바이러스입자의 ratio를 알아낸 다음, 알고 있는 표준입자의 농도로부터 바이러스입자의 농도를 계산해 낼 수 있다.




바이러스의 정량법/ 강정옥 / 한양대학교 의과대학 구리병원 임상병리과 /대한임상미생물학회지 : 제4권 제1호 2001